长叶猕猴桃初始无菌组培体系建立

蔡冬元（湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙410127）

长叶猕猴桃初始无菌组培体系建立

蔡冬元
（湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙410127）

长叶猕猴桃（Actinidia hemsleyana Dunn.）属猕猴桃科猕猴桃属，为多年生缠绕类大型落叶藤本植物。雌雄异株，叶片大多呈长披针形[1-2]。果实富含维生素、氨基酸和微量元素，具有清热解毒、祛风除湿之功效[1-4]。叶、根含许多生物活性物质和其他医药成分，对早期快速生长的肿瘤具有明显抑制作用[5-6]。虽然长叶猕猴桃在市场与医药方面发展前景广阔，但自然资源并不十分丰富，加上采挖强度大，致使资源日趋减少[7]。利用植物组织培养技术生产并快速推广长叶猕猴桃优良品系，扩大种群数量，具有重要的意义。当前有关猕猴桃组织培养的报道较多，但主要集中于食用猕猴桃种类及其种质资源保存方面的研究，尚未见长叶猕猴桃无菌组培体系建立的研究报道[8]。该项目对长叶猕猴桃初始无菌组培体系建立进行了探究，旨在为长叶猕猴桃组培苗的生产和工厂化快速繁育种苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

该试验在湖南生物机电职业技术学院植物组织培养中心进行。研究所需外植体材料取自湖南生物机电职业技术学院藤本植物资源圃。

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分别从长叶猕猴桃植株上剪取当年抽发的半木质化或已木质化的新梢，选取新梢上的带芽茎段、叶柄、刚展开的幼嫩叶片小块作外植体。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

1.2.1.1 外植体的预处理。①将半木质化或已半木质化的新梢剪成2.5～3.0 cm长带芽茎段置于烧杯中，在自来水中冲洗30 min。②将展开的新叶剪成4～9 cm2的离体小块置于烧杯中，在自来水中冲洗30 min。③收集叶柄并置于烧杯中，在自来水中冲洗30 min。

1.2.1.2 外植体的消毒处理。将在自来水下冲洗好的材料沥干水分，置于超净工作台上，带芽茎段与叶柄分别用75%酒精浸泡8 s→无菌水洗1次→用0.1%升汞消毒10 min→无菌水洗7次。

离体叶片小块分别用75%酒精浸泡4 s→无菌水洗1次→用0.1%升汞消毒7 min→无菌水洗7次。

1.2.1.3 外植体的分割与接种。将经过消毒处理后的茎段切成1.0～1.5 cm长的带芽茎段，接种至相关培养基中；将叶片分割成1.0 cm2大小，接种至相关培养基中；将消毒叶柄的陈旧伤口切割后接种至相关培养基中。

1.2.2 双因子试验方法。2012年3月25日、2012年10月12日、2013年3月25日分别以长叶猕猴桃的芽带茎段、叶片、叶柄作外植体展开了三次双因子重复试验。长叶猕猴桃NAA、6-BA的双因子试验见表1。

表1 长叶猕猴桃NAA与6-BA的双因子试验

在3个时间段开展双因子重复试验时，按照上述配方，各配培养基1 L，分装至33个培养瓶中。每种外植体各接种11瓶。将接种好的带芽茎段置于初始培养室中给予5 d暗光培养，后逐渐增加光照时间与光照强度。将接种好的叶柄置于初始培养室中给予10 d暗光培养，后逐渐增加光照时间与光照强度。将接种后的叶片小块置于初始培养室中给予10 d暗光培养，后逐渐增加光照时间与光照强度。培养室中温度为（25±2）℃。

2 结果与分析

2.1 带芽茎段重复对比试验结果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分别利用长叶猕猴桃的带芽茎段作处植体进行为期30 d的双因子重复试验结果表明：①2012年3月25日及2013年3月25日选取的带芽茎段在上述9个培养基中，相比在B培养基中即MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L有最好表现。②茎上侧芽在诱导培养后6 d即开始萌动，至30 d新梢生长健壮，且伤口处出现大量愈伤组织。③2012年10月12日所选取的带芽茎段在B培养基中培养上述相应时间后也有较好表现，但整体表现不如2012年3月25日及2013年3月25日所取带芽茎段的试验结果（表2、图1）。

2.2 新叶小块重复对比试验结果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分别利用长叶猕猴桃的新叶小块作外植体进行为期30 d的双因子重复试验结果表明：①2012年3月25日及2013年3月25日选取的叶块在上述9个培养基中，相比在A培养基中即MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L有最好表现。②暗培养10 d后至初始培养30 d，此时的叶块膨大，叶块面积明显大于接种时的叶面积；叶块边缘出现了明显的愈伤组织。③2012年10月12日所选取的新叶小块在A培养基中也有较好表现，但整体表现不如2012年3月25日及2013年3月25日的试验结果（表2、图2）。

2.3 叶柄重复对比试验结果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分别利用长叶猕猴桃的叶柄作外植体进行为期30 d的双因子重复试验结果表明：叶柄在三次双因子重复试验中，培养期间动态变化不明显（表2）。

3 结论与讨论

（1）长叶猕猴桃的带芽茎段在B培养基即MS＋6-BA1.00 mg/L＋NAA0.10 mg/L中表现最佳；新叶小块在A培养基即MS＋6-BA0.50 mg/L＋NAA0.10 mg/L中表现最佳。

（2）在长叶猕猴桃生长最旺盛的春季选取半木质化或已木质化的带芽茎段、刚展开的新叶作外植体，组培效果比进入秋季时选取相应器官作外植体好。

（3）在以往的关于猕猴桃的组培试验、研究与猕猴桃组培苗的生产中，以带芽茎段作外植体建立初始培养体系常见，尚未见利用叶片作外植体的研究报道。此次研究与重复对比试验中充分利用了新叶作外植体，且已利用其成功建立起了长叶猕猴桃初始无菌组培体系。利用叶片作外植体比利用带芽茎段作外植体，“种子”资源更丰富，可将对母本植株的生长影响与伤害降至最低。

表2 培养30 d时各外植体生长情况比较

图1 带芽茎段在B培养基中的表现

图2 叶块在A培养基中的表现

[1] 冯国楣，李恒，徐祥浩，等.中国植物志49卷二分册[M].北京：科学出版社，1984：218.

[2] 黄宏文，龚俊杰，王圣梅，等.猕猴桃属植物的遗传多样性[J].生物多样性，2000，8（1）：5-12.

[3]张计育，王涛，宣继萍，等.基于江都市果实品质现状的江苏省猕猴桃产业发展对策探讨[J].园艺与种苗，2012（7）：63-65.

[4]葛翠莲，刘科鹏，曲雪艳，等.不同类型猕猴桃果实发育过程中糖酸和Vc含量的动态变化[J].Agricultural Science&Technology，2013，（12）：1772-1774，1778.

[5] 赵云鹏.抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究[D].杭州：浙江大学，2009.

[6]王中炎，钟彩虹，卜范文.红心猕猴桃新品种‘楚红’[J].Agricultural Science&Technology，2004（4）：23-24.

[7]刘平，刘秀菊，杜高楼，等.涌泉灌技术在猕猴桃生产中的应用[J].园艺与种苗，2012（10）：33-35.

[8]李桂君，宋嘉隆，吴捷.葛枣猕猴桃组培繁殖的研究[J].中国新技术新产品，2010（14）：216-217.

（责任编辑 张杨林）

Establishment on Asepsis Tissue Culture System of Actinidia hemsleyana

[目的]建立长叶猕猴桃初始无菌培养体系。[方法]以长叶猕猴桃的带芽茎段、叶柄和叶片为外植体，以MS为基本培养基，展开三次双因子重复试验。[结果]长叶猕猴桃带芽茎段在MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L培养基中初始培养效果好；离体叶片小块在MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L培养基中初始培养效果好。[结论]为长叶猕猴桃组培苗的生产和工厂化快速繁育种苗奠定了基础。

长叶猕猴桃；初始无菌组培体系；建立

CAI Dong-yuan(Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic,Changsha,Hunan 410127)

[Objective]The aim was to establish an asepsis tissue culture system of Actinidia hemsleyana. [Method]Taking the stem with shoots,leafstalks and leaves of Actinidia hemsleyana Dunn.as explants and MS medium as the basic medium,the thrice double factors repeated experiment was carried out.[Result]The best initial medium for the stem with shoot of Actinidia hemsleyana was MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L; MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L was the best initial medium for leaf segments of Actinidia hemsleyana in vitro.[Conclusion]The results laided a foundation for somaclone production and factory rapid breeding seedlings of Actinidia hemsleyana.

Actinidia hemsleyana;Asepsis tissue culture system;Establishment

Q943

A

2095-0896（2014）06-012-03

湖南农业厅一般项目：猕猴桃组培苗快繁配套技术研究与应用（2012NY0015）。

蔡冬元（1964-），女，湖南益阳人，从事苗木生产技术方面课程的教学与研究，E-mail：caidongyuan911@126.com。

2014-04-13