雌激素对白念珠菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3表达的影响

许 莉段逸群∗陈宏翔曾志良王 辉

·论著·

雌激素对白念珠菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3表达的影响

许 莉1段逸群1∗陈宏翔2曾志良1王 辉1

目的: 确定雌激素对白念珠菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体基因表达的影响。方法: 体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,将其分为5组:空白对照组、白念珠菌组、白念珠菌＋10－10mol/L 17β－雌二醇组、白念珠菌＋10－9mol/L 17β－雌二醇组和白念珠菌＋10－8mol/L 17β－雌二醇组。荧光定量PCR检测细胞内NLRP3mRNA表达；Western Blot检测细胞内NF－κBp65和caspase－1p20的活性；酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组细胞培养上清液中白细胞介素－1β(IL－1β)的含量。结果: 巨噬细胞在白念珠菌的刺激下,与空白对照组比较细胞内NLRP3mRNA的表达、NF－κB和caspase－1p20活性和细胞培养上清液中的IL－1β含量均明显升高(P＜0．01)；加入雌激素干预后,随着雌激素浓度的增高,细胞内NLRP3mRNA表达、NF－κB和caspase－1p20活性、细胞培养上清液中的IL－1β含量明显低于对照组(P＜0．01)。结论: 雌激素可能通过抑制NF－κB活性抑制白念珠菌诱导的NLRP3表达、caspase－1的活化和IL－1β的分泌。

白念珠菌； 雌激素； NLRP3； 核因子－κB； 白细胞介素－1β

念珠菌性外阴阴道炎是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病,病原菌大部分为白念珠菌。白念珠菌广泛存在于自然界,是人体正常菌群之一,属于胃肠道和女性下生殖道的正常共栖菌,为条件致病菌。1现已明确白念珠菌引起的感染常与性激素尤其是雌激素的存在有关。2但雌激素是通过何种机制来抑制免疫应答,最终导致念珠菌感染至今仍未阐明。NLRP3炎性体是一类大分子蛋白质,它通过活化caspase－1,调控IL－1β等促炎细胞因子的成熟和分泌,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。3IL－1β为白念珠菌感染时的重要炎症介质,它可通过活化炎性细胞而参与宿主抗白念珠菌的免疫反应。4Bauernfeind等发现脂多糖诱导人外周血单核细胞NLRP3转录的增加依赖核因子(NF)－κB通路的活化。5此外,有研究表明雌激素可影响NF－κB的分泌和表达。6我们推测雌激素可通过影响NF－κB表达进而影响白念珠菌诱导的NLRP3表达及IL－1β分泌。本实验建立小鼠腹腔巨噬细胞白念珠菌感染模型,观察雌激素对白念珠菌刺激后NLRP3炎性体表达的影响,为雌激素在白念珠菌致病机制中的作用提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 主要试剂 RPMI l640培养基(Gibco公司),小牛血清(杭州四季青生物工程公司),17β－雌二醇(sigma),Trizol(invitrogen),逆转录试剂盒(TOYOBO),SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara公司), anti－NF－κBp65单抗(Santa),anti－caspase－1p20单抗(Santa),IL－1βELISA试剂盒(晶美生物制剂公司)。

1．2 菌株 白念珠菌标准株ATCC10231由澳大利亚悉尼Westmead医院感染性疾病和微生物研究中心提供。白念珠菌菌株实验前2天经培养基27℃传代培养,取少量菌落于灭菌的PBS中,1500 r/min离心8 min,洗涤2次,将菌液调成106细胞/mL,台盼蓝染色证实＞95%为活细胞,显微镜下观察＞95%为白念珠菌酵母。

1．3 腹腔巨噬细胞体外培养及处理 雄性BALB/c小鼠(6～8周龄,质量18～20 g)购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。常规分离小鼠腹腔巨噬细胞,加入10 mL含10%小牛血清的RPMI 1640培养液,细胞调整为2×105细胞/m L接种于6孔板中,置37℃培养。待细胞贴壁后,更换RPMI 1640培养基,细胞分为5个实验组:(1)空白对照组:用含10%胎牛血清的RPMI l640培养基常规培养8 h；(2)白念珠菌组:加入106CFU/mL白念珠菌悬液作用8 h；(3)白念珠菌＋10－10mol/L 17β－雌二醇组:预先用10－10mol/L 17β－雌二醇作用细胞2 h,再加入106CFU/mL白念珠菌悬液作用8 h；(4)白念珠菌＋10－9mol/L 17β－雌二醇组:预先用10－9mol/L 17β－雌二醇作用细胞2 h,再加入106CFU/m L白念珠菌悬液作用8 h；(5)白念珠菌＋10－8mol/L 17β－雌二醇组:预先用10－8mol/L 17β－雌二醇作用细胞2 h,再加入106CFU/mL白念珠菌悬液作用8 h。

1．4 SYBR green荧光定量PCR检测细胞中NLRP3 mRNA表达 用Trizol试剂提取细胞总RNA,取1μg总RNA用于逆转录,逆转录按照逆转录酶试剂说明操作。RT－PCR所用引物序列如下:NLRP3上游:5'－CGAGACCTCTGGGAAAAAGCT－3',下游:5'－GCATACCATAGAGGAATGTGATGTACA－3'；内参β－actin:上游5'－TGTCCCTGTATGCCTCTGG－3',下游:5'－CCTTTAGCACGCACTGTAG－3'。反应条件为:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火30 s,40个循环。β－actin作为内参照,NLRP3对β－actin的相对表达量用倍数表示,计算公式为2－△△CT,其中CT值表示荧光信号强度达到设定阈值的循环数,△CT＝目的基因CT－内参基因CT,△△CT＝实验组△CT－对照组△CT。

1．5 免疫印迹分析NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表达 分别提取培养细胞的胞浆蛋白和胞核蛋白。按Lowry比色法,以BSA为标准蛋白,测定样品蛋白浓度。胞浆蛋白用作caspase－1p20蛋白Western Blot分析,核蛋白用作NF－κBp65蛋白Western Blot分析。取各组不同组分蛋白样品15μL(含胞浆蛋白60μg,核蛋白75μg),经10%SDS－PAGE电泳后电转移膜,加入稀释后的一抗37℃孵育1 h,特异性二抗及SPHRP37℃孵育1 h,用0．05%DAB缓冲液避光显色。

1．6 细胞培养上清中IL－1β含量的测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)。按照试剂盒说明进行,实验完成后用酶标仪在450 nm处读取吸光度值,根据制作的标准曲线,用间接法读各样品的IL－1β含量。

1．7 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示,各组均数的比较行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)。应用SPSS 15．0软件进行统计。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 细胞内NLRP3 mRNA表达的变化 RT－PCR结果显示,白念珠菌刺激巨噬细胞后,细胞内NLRP3 mRNA表达明显增加,与空白对照组比较,差异有显著性(P＜0．01)。加入雌激素干预后,随着雌激素浓度的增高,细胞内NLRP3 mRNA表达逐渐降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的细胞内NLRP3 mRNA表达,与白念珠菌组比较,差异有显著性(P＜0．01),见图1。

图1 细胞内NLRP3 mRNA荧光定量PCR结果

2．2 细胞内NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表达的变化 免疫印迹检测结果显示,白念珠菌刺激巨噬细胞后,细胞内NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表达是空白对照组的4．63和5．16倍(均P＜0．01)。加入雌激素干预后,随着雌激素浓度的增高,细胞内NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表达逐渐降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L 17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的细胞内NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表达,与白念珠菌组比较,差异有显著性(P＜0．01),见图2。

图2 NF－κBp65、caspase－1p20免疫蛋白印迹结果

2．3 培养上清液中细胞因子IL－1β含量的变化ELISA结果表明,白念珠菌刺激巨噬细胞后,细胞培养上清液中IL－1β含量明显增加,与空白对照组比较,差异有显著性(P＜0．01)。加入雌激素干预后,随着雌激素浓度的增高,细胞培养上清液中IL－1β含量逐渐降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的IL－1β分泌,与白念珠菌组比较,差异有显著性(P＜0．01)。见表1。

表1 培养上清液中细胞因子IL－1β含量的变化

3 讨论

NLRP3炎性体是一类分子量约为700 kDa的大分子蛋白复合体,在细胞质内发挥外源性微生物或内源性危险信号感受器的作用,是活化半胱天冬酶－1 (caspase－1)的分子平台。NLRP3炎性小体的活化可致无活性的caspase－1前体转化为活性caspase－1,后者可裂解IL－1β、IL－18、IL－33前体以形成活性形式并分泌。3Hise等发现NLRP3敲除鼠对白念珠菌的抵抗力显著减弱,7说明NLRP3炎症小体在宿主抵抗白念珠菌的感染中发挥保护作用。在本实验中我们发现,白念珠菌刺激巨噬细胞后NLRP3 mRNA明显增加,胞浆内caspase－1的活化形式caspase－1p20蛋白表达明显增加,细胞因子IL－1β的表达亦相应明显增加。这一结果表明在白念珠菌感染中NLRP3炎性体参与了caspase－1活化及IL－1β的分泌。IL－1β是白念珠菌引起的机体天然免疫反应最主要的炎症因子,可刺激其他细胞因子和炎症递质的产生,增强细胞免疫和体液免疫介导的抗真菌免疫反应及组织损伤过程。4

性激素与性传播疾病关系非常密切,有研究表明性激素可以调节女性生殖道衣原体感染的易感性和炎症反应。8Shew等发现雌激素是人乳头瘤病毒致病的主要辅助因子之一,它可通过调控细胞因子水平来影响CA的发生与转归。9Kalo－Klein等发现孕妇及在黄体期的女性容易感染白念珠菌。10这些说明雌激素具有免疫调节功能,能影响机体对微生物的易感性。

NF－κB是广泛存在于人体组织细胞中的转录因子,最常见的家族成员是p65/p50异源二聚体,对众多基因发挥转录调节作用。NF－κB的激活包括IκB酶诱导的IκB－α的磷酸化和降解,导致NF－κB释放,继而NF－κB活化而转入核内。11Ghisletti等发现17β－雌二醇预处理能有效地抑制脂多糖引起的巨噬细胞NF－κB亚基的核转位,且NF－κB亚基核转位的抑制反应了NF－κB活性的下降。6本实验中,预先加入不同浓度的雌激素作用后,白念珠菌刺激的NLRP3 mRNA表达、胞浆内caspase－1p20蛋白表达及细胞因子IL－1β的分泌随着雌激素浓度的增加而逐渐降低,且这种降低趋势与核内NF－κBp65蛋白的减少一致。这表明雌激素可抑制NLRP3表达及IL－1β分泌,且这种抑制作用可能是通过抑制NF－κB活性实现的。

在我们的研究中发现,NLRP3炎性体参与了白念珠菌感染时致炎因子IL－1β的分泌,雌激素可以剂量依赖的方式抑制NLRP3表达及IL－1β分泌,这种抑制作用可能与雌激素抑制NF－κB活性有关。这为解释雌激素在女性白念珠菌感染中的作用机制提供一定的理论依据。接下来我们将进行小鼠体内实验研究,以期能阐明雌激素调控NLRP3炎性体的机制。

1 Sobel JD．Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis．Clin Infect Dis,1992,14:148－153．

2 Fidel PL Jr,Cutright J,Steele C．Effects of reproductive hor-mones on experimental vaginal candidiasis．Infect Immun,2000, 68(2):651－657．

3 Kanneganti TD,Ozoren N,Body－Malapel M,et al．Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase－1 through cryopyrin/NLRP3．Nature,2006,440(7081):233－236．

4Vonk AG,Netea MG,Krieken JH,et al．Endogenous interleukin(IL)－1 and IL－1 are crucial for host defense against disseminated candidiasis．J Infect Dis,2006,193(10):1419－1426．

5Bauernfeind FG,Horvath G,Stutz A,et al．NF－κB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression．J Immunol, 2009,183(2):787－791．

6Ghisletti S,Meda C,Maggi A,et al．17β－estradiol inhibits inflammatory gene expression by controlling NF－κB intracellular localization．Mol Cell Biol,2005,25(8):2957－2968．

7Hise AG,Tomalka J,Ganesan S,etal．An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans．Cell Host Microbe,2009,5(5):487－497．

8 Kaushic C,Zhou F,Murdin AD,et al．Effects of estradiol and progesterone on susceptibility and early immune responses to Chlamydia trachomatis infection in the female reproductive tract．Infect Immun,2000,68(7):4207－4216．

9 Shew ML,McGlennen R,Zaidi N,et al．Oestrogen receptor transcripts associated with cervical human papillomavirus infection．Sex Transm Infect,2002,78(3):210－214．

10 Kalo－Klein A,W itkin SS．Candida albicans:Cellular immune system interactions during different stages of the menstrual cycle．Am JObstet Gynecol,1989,161(5):1132－1136．

11 Konia MR,Schaefer S,Liu H．Nuclear factor－κB inhibition provides additional protection against ischaemia/reperfusion injury in delayed sevoflurane preconditioning．Eur J Anaesthesiol,2009,26(6):496－503．

(收稿:2013－09－29)

Effect of estrogen on candida albicans－induced NLRP3 expression in murine peritonealm acrophages

XU Li,DUAN Yi-qun,CHEN Hong-xiang,et al.Department ofDermatology,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan, 430022

Objective:To investigate the regulatory effectsof estrogen on NLRP3 expression inmurine peritonealmacrophages induced by candida albicans．Methods:Murine peritoneal macrophages were cultured and randomly divided into five groups:blank control group,C.albicans group,C.albicans＋10－10mol/L－17β－estradiol group,C.albicans＋10－9mol/L－17β－estradiol group and C.albicans＋10－8mol/L－17β－estradiol group．ThemRNA expressionsof NLRP3 in the cellswere determined by real－time PCR．Western blotwas performed to determine the activities of NF－κB and caspase－1p20．The protein of interleukin－1β(IL－1β)were determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)．Results:The mRNA expressions of NLRP3, the activities of NF－κB and caspase－1p20 in macrophages and the levels of IL－1βin the supernatant increased significantly when compared to the controls(P＜0．01)．After adding estrogen into the cells challenged with C.albicans,themRNA expressions of NLRP3,the activities of NF－κB and caspase－1p20 inmacrophages and the levels of IL－1βin the supernatant decreased with the increasing of estrogen concentrations,when compared to the control group(P＜0．01)．Conclusion:Estrogen can inhibit the expressions of NLRP3,the activation of caspase－1 and the production of pro－inflammatory cytokines IL－1βinmacrophages challenged with C.albicans,through inhibiting the activities of NF－κB．

candida albicans；estrogen；NLRP3；nuclear factor－κB；interleukin－1β

国家自然科学基金资助项目(编号:81101201,81171495, 81271765)

1武汉市第一医院皮肤科,武汉,430022

2华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科,武汉, 430022

∗通信作者