解脲脲原体血清型1和4在雌性小鼠生殖道中的致病性研究

张 骋史同新∗杨彦华孟慧娟孙文龙

解脲脲原体血清型1和4在雌性小鼠生殖道中的致病性研究

张 骋1史同新1∗杨彦华2孟慧娟3孙文龙4

目的: 确定解脲脲原体(UU)血清型1(UU1)和4(UU4)在小鼠生殖道中致病性。方法:将408只小鼠随机分为UU1组和UU4组,实验组阴道分别接种三种浓度UU标准株菌液。接种后不同时间点随机检测阴道、宫颈及部分上生殖道组织中UU阳性率及致病率。结果: (1)阴道和宫颈分泌物:UU1和UU4三组之间总阳性率的差异均有统计学意义(P＜0．01)；UU1和UU4三组之间各组各时间点浓度比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。(2)宫颈、子宫体与输卵管组织:UU4组阳性率、总致病率均高于UU1组,差异均有统计学意义(P＜0．05)。结论: (1)UU1和UU4主要在宫颈致病。(2) UU4的致病性比UU1强。

解脲脲原体； 生殖道； 致病性； 血清型； 小鼠

解脲脲原体(Ureaplasma urealytium,UU)是人类泌尿生殖道中最常检出的微生物之一。已有报道UU与人类多种临床疾病相关,且致病性可能与不同血清型相关。我们既往通过对正常人群不同年龄阶段泌尿生殖道流行病学调查中,发现UU可能是正常人群泌尿生殖道中的定植菌,其致病性可能与在生殖道部位等有关。本研究拟通过建立生物一群的血清型1 (UU1)和生物二群的血清型4(UU4)的小鼠动物模型,来探讨UU在泌尿生殖道中不同生物群血清型不同浓度及部位的致病性。

1 材料与方法

1．1 实验动物 SPF级雌性昆明小鼠408只,小鼠8周龄,体重24±2 g,购于青岛大学医学院动物实验中心。

1．2 实验方法

1．2．1 主要试剂及设备 冻干标准株UU1和UU4 (由南华大学病原微生物教研室提供)、苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份有限公司)、UU液体培养基(珠海浪峰生物技术有限公司产品)、FQ－PCR试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)、ABI－7300 PCR仪(美国ABI公司)。

1．2．2 动物模型的建立 408只昆明小鼠全部每周颈部皮下注射一次苯甲酸雌二醇,连续2周,剂量为0．5 mg/只,然后将全部小鼠完全随机分为UU1组和UU4组,每组204只小鼠。将UU1、UU4组分别分为A、B、C 3组实验组(每组各60只)和对照组(每组各24只)分笼饲养。将UU1、UU4冻干标准株复苏后分别培养增菌配制成105、106、107copy/g后在无麻醉状态下用微量移液器分别接种至A、B、C实验组小鼠阴道内,对照组D接种无菌液体培养基。所有小鼠接种剂量均为每只50μL。

1．2．3 分泌物标本采集及FQ－PCR测定 将单独包装的每只小鼠2支无菌棉拭子分别称重,于接种后的第1、3、7、14、28、42天随机取UU1和UU4组各实验组的10只和对照组4只小鼠,将其处死。将第1根棉拭子伸入小鼠阴道0．5～1 cm停留5 s后转动数周取其阴道分泌物。然后将小鼠宫颈管前壁切开,用棉拭子在宫颈管内旋转数周取宫颈分泌物。将每支棉拭子放回试管中再次称重,两次称重之差作为分泌物的重量。将分泌物立即洗入1 m L灭菌生理盐水中充分震荡摇匀,挤干棉拭子。吸取全部液体转至1．5 m L离心管中,12 000 r/min离心5 min后加入50μL DAN提取液充分混匀后100℃恒温处理10±1 min再离心,吸取2μL上清液做PCR反应。严格按照FQPCR试剂盒说明书操作进行标准品的稀释及设定循环参数,每次均设阳性及阴性对照并作标准曲线。计算UU的浓度,按Copy/g＝(Copy/mL×0．05 m L)/G计算每克分泌物中的UU数量。

1．2．4 组织UU液体培养基检测 剪取各个时间点解剖的小鼠子宫体、输卵管及卵巢小块组织加入UU液体培养基置于37℃温箱培养,24～48 h观察结果,以培养基颜色由黄色变为红色且澄清判断为阳性。

1．2．5 组织学形态观察 剪取阴道、宫颈以及剩余部分的子宫体、输卵管及卵巢组织以10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片,HE染色后进行光镜下观察。小鼠生殖道炎症程度分级,轻度:黏膜层散在个别炎症细胞；中度:黏膜层有较多炎症细胞呈灶状或片状浸润；重度:大量炎症细胞弥漫性浸润或伴有脓肿形成。镜下观察到以中性粒细胞浸润为主者为急性炎症,镜下观察到以淋巴细胞或浆细胞为主者为慢性炎症。将中度和重度炎症的标本设定为致病标本,其余为正常标本,计算各组小鼠致病率。

1．3 统计学方法 采用SPSS 17．0软件进行统计学分析。各组变量间采用Fisher精确检验,浓度的比较采用非参数检验,以P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 接种后小鼠分泌物UU阳性情况及UU浓度。接种第1天UU1和UU4组6组实验组小鼠阴道、宫颈分泌物UU的检出率均为100%。

2．1．1 阴道分泌物检测情况:

2．1．1．1 接种UU后总检出率 A1、B1、C1组阳性率为33．33%(20/60)、63．33%(38/60)、76．67%(46/ 60),3组间比较差异有统计学意义(P＜0．01)。

A2、B2、C2组阳性率分别为40%(24/60)、68．33%(41/60)、81．67%(49/60),3组间比较差异有统计学意义(P＜0．01)。

UU1和UU4组同种浓度A1、A2,B1、B2,C1、C2组UU阴道阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0．05)。

2．1．1．2 接种后UU1、UU4各实验组阴道UU浓度检测 接种后同一时间点UU1、UU4各实验组之间的浓度差异均有统计学意义(P＜0．01)。同一浓度不同时间点UU1、UU4各组阴道UU浓度比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。各实验组小鼠阴道分泌物UU的浓度随接种浓度的增大而升高,且随接种时间的延长,UU的浓度逐渐降低。UU1和UU4两组对照组小鼠各时间点阴道分泌物UU检测均为阴性,见表1。

2．1．2 宫颈分泌物检测:

2．1．2．1 接种UU后总的阳性率 A1、B1、C1组阳性率分别为41．67%(25/60)、71．67%(43/60)、85% (51/60),3组间比较差异有统计学意义(P＜0．01)。

A2、B2、C2组UU阳性率分别为46．67%(28/ 60)、76．67%(46/60)、88．33%(53/60),3组间比较差异有统计学意义(P＜0．01)。

UU1和UU4的同种浓度A1、A2,B1、B2,C1、C2组UU宫颈阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0．05)。

2．1．2．2 接种后UU1、UU4各实验组宫颈UU浓度检测 接种后同一时间点UU1、UU4各实验组之间的浓度差异均有统计学意义(P＜0．01)。同一浓度不同时间点UU1、UU4各组宫颈UU浓度比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。各实验组小鼠宫颈分泌物UU的浓度随接种浓度的增大而升高,且随接种时间的延长,UU的浓度逐渐降低。UU1和UU4两组对照组小鼠各时间点宫颈分泌物UU检测均为阴性,见表2。

2．2 接种后小鼠部分器官组织中UU培养情况 对照组各时间点子宫体、输卵管、卵巢UU培养均为阴性。

2．2．1 子宫体接种后前3 d各实验组培养均为阴性,至接种后第7～42 d,A1、B1、C1组子宫体培养阳性率比较差异有统计学意义(P＜0．05)。A2、B2、C2组子宫体培养阳性率比较差异有统计学意义(P＜0．05)。UU1、UU4组子宫体UU培养总阳性率比较差异有统计学意义(P＜0．05),见表3。

表1 各实验组阴道分泌物的UU阳性率及平均浓度

表2 各实验组宫颈分泌物UU的阳性率及平均浓度

表3 子宫体UU培养情况

表4 输卵管UU培养情况

2．2．2 输卵管接种后1～7 d,各实验组小鼠培养均为阴性,至接种后14～42 d,A1、B1、C1小鼠输卵管培养阳性率比较差异无统计学意义(P＞0．05)。A2、B2、C2输卵管阳性率比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。UU1、UU4组输卵管UU培养总阳性率比较差异有统计学意义(P＜0．05),见表4。

2．2．3 接种后各时间点各实验组卵巢UU培养均为阴性。

2．3 接种UU后小鼠各组织器官形态学表现

2．3．1 肉眼大体观察:

2．3．1．1 对照组 小鼠外阴均正常,阴道、宫颈、子宫、输卵管以及卵巢的形态无明显改变(图1)。

2．3．1．2 实验组 解剖小鼠后第3 d,B1、C1组分别有1、2只,B2、C2组有2、4只表现为阴道水肿,宫颈肥大,A2组有1只小鼠阴道壁充血水肿。至接种至第7 d,A1组有3只小鼠阴道壁充血,C1组有2只, B2、C2组有1、3只发生阴道壁水肿合并宫腔积液、输卵管水肿并充血(图2),至14 d除C2组有2只小鼠输卵管充血外,其余肉眼观均恢复正常。

2．3．2 光镜下观察:

2．3．2．1 阴道组织光镜下观察 接种UU后对照组各时间点阴道组织镜下观察未见异常。

接种UU后3～7 d,UU1、UU4各实验组小鼠阴道组织镜下观察呈急性炎症表现(图3),3组致病率比较差异均无统计学意义(P＞0．05)。UU1、UU4两组3～7 d,A1、A2,B1、B2,C1、C2致病率比较均无统计学意义(P＞0．05)。UU1、UU4组3～7 d阴道致病率比较差异无统计学意义(P＞0．05)。

接种后14～28 d,UU1、UU4各实验组小鼠阴道致病率比较,差异均无统计学意义(P＞0．05),小鼠阴道组织镜下观察为慢性炎症(图4)。至接种后42 d, UU1、UU4各实验组小鼠阴道镜下观察表现为轻度炎症,严重程度与对照组无差异。

接种后3～28 d,UU1、UU4各实验组小鼠阴道致病率比较差异均无统计学意义(P＞0．05)。UU1、UU4组3～28 d阴道总致病率比较差异无统计学意义(P＞0．05),见表5。

2．3．2．2 宫颈、子宫体、输卵管、卵巢光镜下观察:

接种UU后对照组各时间点宫颈、子宫体、输卵管、卵巢均未发现异常。

图1 正常小鼠子宫、输卵管、卵巢外观图2 接种UU后子宫、输卵管水肿图3 阴道黏膜固有层内见较多中性粒细胞及淋巴细胞浸润(HE,×200)

图4 阴道黏膜固有层内见少量淋巴细胞浸润(HE,×200)图5 宫颈黏膜固有层内见较多中性粒细胞浸润(HE,×200)图6 宫颈壁组织内较多淋巴细胞、浆细胞浸润(HE,×200)

表5 各实验组小鼠阴道致病情况

表6 各实验组小鼠宫颈致病情况

接种后3～14 d,小鼠宫颈管光镜下观察为急性炎症(图5),UU1、UU4组3个实验组间宫颈致病率比较差异均有统计学意义(P＜0．05),其中C1与C2组致病率差异有统计学意义(P＜0．05),A1、A2,B1、B2,两组比较差异均无统计学意义(P＞0．05)；接种后28～42 d,宫颈镜下观察为慢性炎症(图6),A1、B1、C1组致病率比较差异无统计学意义(P＞0．05),A2、B2、C2组宫颈致病率比较差异有统计学意义(P＜0．05)。其中C1与C2组致病率差异均有统计学意义(P＜0．05),其它各组比较差异均无统计学意义(P＞0．05)。接种后3～42 d,UU1、UU4组总致病率比较差异有统计学意义(P＜0．05),见表6。

接种后1周内,子宫内膜无明显炎细胞浸润,至接种后7～14 d,小鼠子宫体光镜下观察为急性炎症。A1、B1、C1组致病率为5%(1/20)、30%(6/20)、40% (8/20),A2、B2、C2组致病率为5%(1/20)、40%(8/ 20)、50%(10/20),3组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。其中第14 d,C1、B2、C2组分别合并2、1、4只输卵管炎,至接种后28～42 d,A1、B1、C1组致病率为0(0/20)、10%(2/20)、10%(2/20),3组间比较差异无统计学意义(P＞0．05)。A2、B2、C2组致病率为5% (1/20)、35%(7/20)、40%(8/20),3组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。其中B1、C1组各有1只小鼠合并输卵管炎,A2、B2、C2组分有1、2、4只小鼠合并输卵管炎。7～42 d,UU1、UU4组子宫体和输卵管致病率为15．83%(19/120)、29．17%(35/120),2组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。

各实验组各时间点卵巢均未见明显异常。

3 讨论

UU是人类泌尿生殖道中最常检出的微生物之一,其致病性目前仍有较大争议。既往有研究表明, UU与多种临床疾病相关,其中可能与输卵管炎导致的异位妊娠有关,1以及与不孕不育也有很大关系。2国内外有学者研究发现UU的致病性可能与不同血清型有关,但各研究结果不尽相同。我们既往对青岛地区不同年龄段的健康人群泌尿生殖道中的UU进行了流行病学的研究,结果发现UU在健康新生儿、健康幼儿、学龄前儿童、中小学生泌尿道中均有不同程度UU存在,3－5以生物一群为主,但生物二群也有不小的比例,并且女性携带率高于男性,提示UU在健康人群各个年龄段泌尿道中均存在不同程度的携带状态,同时说明其致病性可能也与器官不同部位有关。本研究通过建立不同浓度生物一群的血清型1和生物二群的血清型4的动物模型,对雌性小鼠生殖系统不同部位进行了不同方法研究。

研究结果发现,实验组小鼠阴道分泌物UU的浓度随接种浓度的增大而升高,且随接种时间的延长, UU的浓度逐渐降低,至观测结束时小鼠阴道分泌物中有不同程度的UU存在,且UU1、UU4在阴道分泌物中的检出率无明显差异,这与Furr等研究结果相似,6说明UU在小鼠生殖道中虽然有一定的自净能力但并不能很快被清除,同时提示其检出率可能与生物群及血清型无关。光镜下观察阴道组织发现,接种UU后,UU1、UU4无论是在急性炎症期还是在慢性炎症期其致病率各实验组也无差异,进一步提示UU1、UU4在阴道中的致病性可能与浓度和血清型无关。同时发现,至接种后42天所有小鼠阴道无明显炎症,与对照组小鼠阴道镜下观察无明显差异。上述结果可以推断,小鼠阴道具有一定的自净作用,可以携带低浓度UU且不致病,提示人类可能具有同样的现象。

对实验组小鼠宫颈的研究发现,其分泌物中UU的浓度也随接种浓度的增大而升高,随接种时间的延长浓度逐渐降低,至观测结束时分泌物中有不同程度的UU存在,且UU1、UU4的检出率无明显差异,与阴道相似。但国内李华等7用UU3研究发现,接种后第35天所有小鼠宫颈分泌物中均无UU3检出。本研究结果显示至接种后42天宫颈分泌物中仍有低浓度的UU检出,这是否由不同血清型在小鼠生殖道中的自净能力不同导致尚需进一步研究。同时,在光镜下观察宫颈组织,发现在接种后3～14天,组织表现为急性炎症,在28～42天,观察为慢性炎症,其中C1与C2组致病率均有差异。同时研究发现,3～42天UU1、UU4各实验组总的致病率有差异。提示UU1、UU4在宫颈均可引起炎症改变,在低浓度时两者致病性相似,但随着UU的浓度增大致病率升高,且UU4的致病力比UU1强,与谭飞等8研究结果一致。

本研究对子宫体、输卵管、卵巢组织进行UU培养发现,在子宫体及输卵管均有UU存在,其检出率明显低于宫颈,且UU4的检出率明显高于UU1,卵巢均未培养出UU。光镜下,两者在子宫体和输卵管均可引起不同程度的炎症改变,且UU4的致病率明显高于UU1。提示UU在生殖道中可发生上行感染, UU4的致病性比UU1强。国内李华等7将不同浓度的UU3接种小鼠阴道,结果发现UU3可上行感染引起子宫内膜炎及输卵管炎,且随接种浓度的增高致病性增强,与本研究结果相似。

国内张帝开等9认为当UU的定量值大于1× 106ccu/mL时致病率明显升高,本研究结果也呈现类似变化趋势。整个实验过程中均未见卵巢致病,这与既往研究UU8可上行播散至卵巢致病6有差异,这不排除UU1和UU4致病力比UU8弱或接种浓度较低暂未上行至卵巢所致。

目前,不同血清型的UU致病能力有差异的原因尚不明确。既往研究表明,不同血清型UU在生殖道中不同部位的黏附能力强弱有差异,10Furr等11通过电镜观察到的类似UU的人型支原体定植部位为宫颈的柱状上皮而非阴道复层鳞状上皮。本实验结果也提示同样的结果。

因此,通过对小鼠动物模型的研究发现,UU1和UU4主要在宫颈致病,在阴道可致短期炎症,UU4在宫颈和子宫、输卵管的致病性比UU1强,且致病力随UU感染的浓度增大而增强。

1梁旭东,顾亭亭,王建六,等．不同生物亚群解脲脲原体感染与异位妊娠相关性的研究．中华妇产科杂志,2007,42(6): 370－373．

2 Imudia AN,Detti L,Puscheck EE,et al．The prevalence of ureaplasma urealyticum,mycoplasma hominis,Chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae infections and the rubellastatus of patients undergoing an initial infertility evaluation．JAssist Reprod Cenet,2008,25(1):43－46．

3刘立倩,史同新,管淑梅,等．健康足月分娩新生儿泌尿生殖道解脲脲原体的流行病学研究．中国麻风皮肤病杂志,2007, 23(12):1057－1059．

4史同新,徐敬星,赵光．解脲脲原体在健康幼儿泌尿生殖道中的分子流行病学研究．中国艾滋病性病,2008,14(4):389－391．

5孟慧娟,史同新,孙文龙,等．青岛地区中小学生泌尿生殖道解脲脲原体及人型支原体分子流行病学调查．中华皮肤科杂志,2012,45(10):708－710．

6 Furr PM,Taylor－Robinson D．The establishment and persistence of Ureaplasma urealyticum in oestradiol－treated female mice．JMed Microbiol,1989,29(2):111－114．

7李华,张洪文,陈浦香,等．解脲脲原体血清型3在小鼠生殖道中的致病性．中华妇产科杂志,2009,44(3):204－208．

8谭飞,连娟,莫小辉,等．UU1、UU3和UU4致昆明小鼠下生殖道致病性的研究．现代生物医学进展,2011,3(11):456－459．

9张帝开,贾春容,李秀云,等．女性下生殖道解脲支原体的定量检测及致病性研究．中国实用妇科与产科杂志,2005,21 (11):656－658．

10Manchee RJ,Taylor－Robinson D．Studies oil the nature of receptors involved in attachment of tissue culture cells tomycoplasmas．Br JExp Pathol,1969,50(1):66－75．

11 Furr PM,Sarathchandra P,Hetherington CM,eta1．Siteof localization of Mycoplasma pulmonis and Mycoplasma hominis in the genital tract of female mice demonstrated by culture and scanning and immuno－electron microscopy．Int J Exp Pathol, 1995,76(2):131－143．

(收稿:2013－10－22 修回:2013－11－27)

Pathogenicity of ureaplasma urealyticum serotype 1 and 4 in genital tract ofm ice

ZHANGCheng,SHITong-xin,YANG Yan-hua,etal.Department ofDermatology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao,266011

Objective:To determine the pathogenicity of ureaplasma urealyticum serotype 1(UU1)and 4 (UU4)in genital tract ofmice．Methods:A total of 408 adult Kunmingmice were random ly divided into 2 groups:UU1 and UU4 group．Three different concentration of UU1 and UU4 were inoculated intra－vaginally．The quantity of UU1 and UU4 from vaginal secretions,cervical secretions,and the uterus,fallopian tubes and ovaries at different time pointswas detected．The pathogenicity was calculated．Results:(1)vaginal secretions and cervical secretions:the differences of the total positivity rates in both UU1 and UU4 groupswere significant(P s＜0．01)；the differenceswere also significantwith different concentration and at different time in both UU1 and UU4(P s＜0．05)．(2)uterus and fallopian tubes:the total positivity rates of UU and pathogenicity in UU4 group were higher than those in UU1 group(P s＜0．05)；Conclusion:UU1 and UU4 primarily cause inflammation in cervix．The pathogenicity of UU4 is stronger when compared with UU1．

Ureap lasma urealyticum；urogenital tract；pathogenicity；serotype；mice

青岛市科技局资助项目(编号1033413nsh)

1青岛大学医学院附属青岛市市立医院皮肤科,山东青岛, 266011

2青岛大学医学院附属青岛市市立医院病理科,266011

3潍坊医学院附属医院皮肤科,山东潍坊,261031

4青岛市第八人民医院皮肤科,山东青岛,266100

∗通信作者