CYP11B2基因第2内含子转位与醛固酮瘤发病的关系

[摘要] 目的 探讨醛固酮瘤CYP11B2基因第2内含子（intron 2）转位与醛固酮瘤患者发病之间的关系。 方法 应用PCR检测醛固酮瘤（66例）、醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤组织（38例）和正常肾上腺组织（14例）CYP11B2基因intron 2多态性（野生型/转位型）。 结果 在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2转位发生率为31.81%，醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤组织为20.05%，正常肾上腺组织为14.29%，三者之间无统计学差异。 结论 醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2转位与醛固酮瘤的发生无显著关联。

[关键词] CYP11B2；intron 2转位；醛固酮瘤

[中图分类号] R736.6 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）05-0129-02

醛固酮瘤是原发醛固酮增多症中最常见的一种，共同的特点是醛固酮的自主分泌及肾素被抑制。醛固酮的自主分泌是人们研究的热点，人们已从基因水平上展开研究，CYP11B2基因的改变可能导致醛固酮瘤的发生，CYP11B2基因intron 2常常与CYP11B1基因intron 2发生转位，本实验就是研究CYP11B2基因intron 2转位与醛固酮瘤发病之间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2006年5月～2007年11月在武汉同济医院行手术切除并有病理证实为醛固酮瘤患者腺瘤标本66例，醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤组织38例和正常腎上腺组织（取自肾癌患者肾上腺）14例，-80℃保存。其中醛固酮瘤患者腺瘤标本女30例，男36例，年龄16～72岁。肿瘤组织全部取自腺瘤中央部分，每个标本组织重约25 mg。

1.2 DNA提取

用DNeasy试剂盒（德国Qiagen公司）按照说明提取DNA，用比色法检测其浓度，-20℃保存。

1.3 PCR检测

Intron 2野生型和转位型基因多态性检测采用2个独立的PCR反应。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，野生型基因上游引物5TGGAGAAAAGCCCTACCCTGT-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3；转位型基因上游引物5-CAGAAAATCCCTCCCCCCTA-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3。PCR反应体系25 μL，按照反应体系：Taq酶master mix 12.5 μL，DNA 1 μg，primer 2 μL加水至25 μL。按反应条件94℃ 30 s，62℃ 15 s，72℃ 22 s，30个循环，72℃延伸5 min扩增目的片段。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶及130 V电压持续电泳30 min，紫外灯下观察电泳带，扩增片段大小约为418 bp。

1.4 统计学方法

采用SPSS12.0统计学软件包，应用χ2检验进行数据处理，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PCR结果：野生型和转位型扩增片段大小均为418 bp，在Marker的400～500 bp之间靠近400 bp处可见扩增片段，只有野生型片段者为WW型，只有转位型片段者为CC型，野生型和转位型片段均有则为WC型。PCR结果如图1。

图1 PCR结果（C为转位型，W为野生型）

醛固酮瘤患者66例，WW型45例，WC型18例，CC型3例。醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤组织38例中WW型30例，WC型8例，CC型0例；正常肾上腺组织（14例）WW型12例，WC型2例，CC型0例。在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2转位发生率为31.81%，醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤组织为20.05%，正常肾上腺组织为14.29%，醛固酮瘤与醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤χ2=1.808，醛固酮瘤与正常组织χ2=0.983；醛固酮瘤肿瘤旁腺瘤与正常组织χ2=0.008，P均>0.05。

3 讨论

原发性醛固酮增多症（简称原醛）是指由于肾上腺皮质分泌过多的醛固酮而引起潴钠排钾，血容量增多而抑制了肾素活性的一种病症，临床表现为高血压和低血钾综合征群，肾上腺醛固酮瘤（APA，又称Conn综合征）是其最常见一种。醛固酮在球状带由醛固酮合成酶催化合成，研究发现醛固酮合成酶基因mRNA在醛固酮瘤中呈现高表达[1]。醛固酮合成酶基因的改变可能引起其mRNA在醛固酮瘤中呈现高表达。11B羟化酶在束状带催化合成皮质醇。但是实验中我们在醛固酮瘤中也发现了CYP11B1基因的表达[1]。说明皮质醇合成酶在醛固酮合成过程中可能有一定的作用，并且CYP11B1和CYP11B2基因常常发生联系。

有人对醛固酮瘤组织中和外周血中CYP11B2基因进行测序并没有发现在这些基因编码区有突变的地方[2]，mRNA是由DNA经hnRNA剪接而成，基因表达时，其外显子和内含子均转录到hnRNA，hnRNA在移出细胞核前将内含子等部分剪除转变为mRNA。现代研究发现内含子可影响基因的表达，也可以增加mRNA的稳定性。内含子在基因表达中的作用愈来愈受到人们重视。

CYP11B1和CYP11B2基因位于同一基因，相距很近，高度同源，二者的第二位内含子常常发生转位。CYP11B1基因的二号内含子转位到CYP11B2基因的第二内含子上，可能会引起CYP11B2基因转录发生变化，但是具体还不清楚。不是每个醛固酮瘤患者CYP11B1基因的二号内含子转位都到CYP11B2基因的第二内含子上，其发生率报道不一，Inglis[3]研究了27例APA中intron 2多态性在原醛和正常人群中的差异，发现intron 2转位型基因（约70%）明显高于正常。Jerome等[4]在高血压患者中研究发现在高ARR值[>145 mol/（L·ng）]患者中intron 2转位型基因明显高与低ARR值患者。但是在我们的实验中并未发现APA患者intron 2转位型基因高于正常人，它也与腺瘤旁肾上腺组织无明显差别，这种结果差别也可能与人种或研究数量有关。在正常人群中也发现CYP11B2基因intron 2转位，说明CYP11B2基因intron 2转位与CYP11B2基因mRNA高表达并无必然直接联系。CYP11B2基因intron 2转位与其启动子区-344T/C位点存在连锁不平衡性。Inglis[3]发现APA中CYP11B2基因intron 2转位与其启动子区-344T/C位点有显著连锁不平衡性（P < 0.01），Jerome等[4]报道在高血压并高ARR患者中CYP11B2基因intron 2转位与其启动子区-344T/C位点有显著连锁不平衡性（P < 0.01）。不排除CYP11B2基因intron 2转位是通过与其有连锁不平衡性位点即启动子区-344T/C位点起作用。但是现在关于-344T/C位点报道结果也不一致。我们发现C等位点与醛固酮瘤患者高醛固酮血症有关[5]。有人则认为T等位点与高醛固酮血症有关[6]；也有人认为CYP11B2基因启动区-344T/C等位点C/T没有显著性差别[7]。

所以，虽然CYP11B2基因intron 2转位是CYP11B2基因上常见突变，但是本研究发现其与APA患者血中高醛固酮无显著关联。

[參考文献]

[1] 邓西元，欧阳金芝，王保军，等. 11β羟化酶、醛固酮合成酶和类固醇合成因子基因在醛固酮瘤中的表达[J]. 中华实验外科杂志，2008，25（10）：1350.

[2] Takeda Y，Furukawa K，Inaba S，et al. Genetic analysis of aldosterone synthase in patients with idiopathic hyperald osteronism[J]. Clin Endocrinol Metab，1999，84（5）：1633-1637.

[3] Inglis GC，Plouin PF，Friel EC，et al. Polymorphic differences from normal in the aldosterone synthase gene （CYP11B2） in patients with primary hyperaldosteronism and adrenal tumour （Conns syndrome）[J]. Clin Endocrinol（Oxf），2001，54（6）：725-730.

[4] Jerome N，David B，Lucas A，et al. A biallelic gene polymorphism of CYP11B2 predicts increased aldosterone to rennin ratio in selected hypertensive patients[J]. Clin Endocrinol Metab，2003，86（6）：2495-2500.

[5] 邓西元，张旭. 醛固酮瘤CYP11B2基因C-344T位点单核苷酸多态性与其发病关系[J]. 现代泌尿外科杂志，2010， 15（5）：336-337，372.

[6] Hautanena A，Lanlinen L，Kupari M，et al. Associations between aldosterone synthase gene polymorphism and the adrenocortical function in males[J]. J Intern Med，1998，244（1）：11-18.

[7] Tsujita Y，Iwai N，Katsuya T，et al. Lack of association between genetic polymorphism of CYP11B2 and hypertension in Japanese： the suita study[J]. Hypertens Res，2001，24（2）：105-109.

（收稿日期：2013-11-18）