分光光度法快速测定水产品中组胺的含量

赵宇明

（大连市产品质量监督检验所，辽宁大连116021）

分光光度法快速测定水产品中组胺的含量

赵宇明

（大连市产品质量监督检验所，辽宁大连116021）

用三氯乙酸提取水产品中的组胺，再与偶氮试剂反应生成红色化合物，其吸光度与样品中的组胺含量成正比，依此建立了快速测定水产品中组胺的方法。方法的检出限为2.0μg/mL，RSD（n=10）为2.6%，10次测定的平均回收率为99.5%，在0～40μg/mL范围内，r为0.9998。该方法具有快速、稳定的特点，与国标方法所得测定结果基本一致。

组胺；水产品；紫外可见分光光度法

组胺是一种生物碱，广泛存在于动植物体内。鱼类等水产物的机体在腐败过程中组胺酸通过微生物的作用，脱羧产生有毒性的组胺。当人体摄入组胺超过100mg时，即出现不良反应和中毒症状。水产品中组胺的测定方法有生物学法、薄层层析法、液相色谱法、荧光法、分光光度法[1-6]等。我国测定水产品中组胺的方法为国标法（GB/T5009.45-2003《水产品卫生标准的分析方法》）。国标法操作繁琐、费时，存在较多缺陷。研究快速测定组胺含量的方法，对水产品中组胺含量进行有效的实时监测与评价，可以为新检测方法标准的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原理

用三氯乙酸提取水产品中的组胺，再与偶氮试剂反应生成红色化合物，其吸光度与样品中的组胺含量成正比。样品与标准系列比较后定量。

1.2 主要试剂和仪器

FK-A组织粉碎机：江苏环宇；MX-S涡旋振荡器：美国SCILOGEX；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津；HM-120型电子天平：广东东华；Arium611型超纯水器：德国Sartorius公司；THZ-82B恒温水浴：常州智博瑞；PHS-3C型pH计：上海伟业。正戊醇、三氯乙酸、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、组胺标准储备液、对氨基苯磺酸钠、亚硝酸钠等试剂均购自于商业渠道。

1.3 方法

1.3.1 样品测定液的提取

去除样品中不可食用部分，用组织粉碎机捣碎并混匀，准确称取5.00 g左右的试样于具塞三角瓶（或体积适合的聚四氟乙烯离心管）中，加入20mL三氯乙酸溶液（100 g/L），在涡旋振荡器上涡旋约5min后，过滤。残渣用适量水洗涤2次～3次，合并所有滤液，用氢氧化钠溶液（250 g/L）将滤液pH调至5.00±0.05，再用水定容至100mL容量瓶中备用。

1.3.2 标准曲线及样品测定

将组胺标准储备液（100μg/mL）稀释为组胺标准使用液（10μg/mL），在6只20mL具塞比色管中各自准确吸取组胺标准使用液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL，分别补水至5.00mL（相当于0、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg组胺），各管中分别加入5.00mL对氨基苯磺酸钠稀碱溶液（5.0 g/L）和0.30mL亚硝酸钠盐酸溶液（50.0 g/L），涡旋混匀后，室温放置10min～15min，以零管为参比在波长450 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。准确吸取适当体积的样品测定液，按标准曲线同样操作测得吸光度值，并与标准系列比较，计算出样品中组胺含量。

1.3.3 计算公式

式中：X为水产样品中组胺的含量，（mg/100 g）；M为水产样品的质量，g；m1为被测定样液中组胺的质量，μg；V0为测定时吸取被测样液的体积，mL；V1为样品测定液定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 组胺的吸收光谱

按实验方法，350 nm～550nm处进行波长扫描，结果见图1。

图1 组胺的紫外可见吸收光谱Fig.1 Ultraviolet and visible absorption spectrum of histamine

吸光度在350 nm～450 nm内逐渐增加，在450 nm达到最大，之后吸光度逐渐下降，因而选择450 nm作为工作波长。组胺与偶氮试剂的重氮偶合反应是组胺阴离子与亲电试剂在碱性水溶液中反应。偶合后得到红色偶合物，用紫外可见光谱法进行比色定量。

2.2 介质的选择

不同介质所提供的酸碱性环境对萃取效果的影响不同，在pH＞7的条件下更易于组胺与偶氮试剂发生偶合反应的进行，因而提取时应将样品溶液的pH调控到适宜的范围才能确保萃取效果最佳。在pH8.5～13.5区间范围内考察组胺的回收率，结果见图2。

图2不同pH对萃取效果的影响Fig.2 Effect of different pH on the extraction effcinecy

图2 表明，当样品溶液的pH=11.0时，组胺的回收率最高，即萃取的效果最好，因此选择样品溶液的最佳pH为11.0，最佳介质为NaOH溶液。

2.3 反应温度、时间和稳定性

经实验发现，反应时间过短，溶液显橘黄色，本偶联反应在室温条件下10min以上才能充分完成，实验选择在室温下放置10min～15min。在环境温度明显低于室温条件下，改用恒温水浴调节温度在20℃～25℃之间，保温10min～15min。本染料形成后，在适宜的介质中2 h内溶液显棕红色，吸收特征无变化。样品溶液稳定，适合直接测定。

2.4 标准曲线及方法检出限

按上述测定条件，研究了组胺与偶氮试剂结合体系在450 nm处的吸光度A与浓度C（μg/mL）的关系，得到线性回归方程为A=0.019C+0.005 6，相关系数r=0.999 8。线性范围为0～40μg/mL，方法的检出限为2.0μg/mL。

2.5 方法准确度和精密度的确定

取5种不同品种的水产品进行加标，按实验方法显色测定组胺的回收率，考察方法的准确度，结果见表1。

表1 测定方法的准确度实验结果（n=10）Table1 Experiment results of detection method accuracy（n=10）

可见，5种水产样品中，组胺均不同程度检出。本测定方法的回收率为95.1%～105.1%，平均回收率为99.5%，相对标准偏差为2.6%，准确度较高。按实验方法，平行测定6种水产样品各10次，对测得结果进行数据处理，计算出标准偏差S和变异系数C.V%，考察该方法的精密度，结果见表2。

表2 测定方法的精密度试验结果Table2 Experiment results of detection method precision mg/100 g

由表2可见，本方法的标准偏差为0.15～0.23，变异系数为0.001～0.019，精密度较高。

2.6 选择性试验

研究各种铵盐、氨基酸等对10μg/mL组胺标准溶液的影响，结果见表3。

表3 共存物对10μg/m L组胺标准溶液测定的影响Table3 Effects of the fofeign substances on the determination of 10μg/m L histamine standard solution

可见，在±5%相对误差内，大部分共存物的存在对测定无影响，说明该方法具有较好的选择性。

2.7 比较试验

为了进一步考察方法的可行性，取10份水产样品分别用本方法和国标法（对硝基苯胺法）测定组胺含量，结果见表4。

表4 与国标法的比较结果Table4 Compared results of national standard GB and this method mg/100 g

经统计分析，t=1.88，p＞0.05，证明两种方法无明显差异。

3 结论

本方法测定水产品中的组胺含量，避免了国标法中致癌物对硝基苯胺的使用。通过准确控制反应体系的pH，使显色反应稳定，便于比色操作。方法简单、快速、回收率较高，方法的重现性和稳定性好，与国标法相比，测定结果无明显差异，适合于水产品中的组胺含量的检测，具有一定的应用和推广价值。

[1]金安宝.水产品中组胺测定方法的改进[J].中国卫生检验杂志, 2007,17(1):149-150

[2]王永根,沈永伟,王剑波.水产品中组胺检测方法的探讨[J].职业与健康,2007,23(8):657

[3]郝宏兰.水产品中组胺的测定方法研究[J].食品科学,2000,21(8): 46-48

[4]窦红顺.水产品组胺检测方法的改进[J].福建纺织,2013(6):37-42

[5]王丽玲,白艳玲.水产品组胺测定中盐酸量对结果影响的探讨[J].现代科学仪器,2001(5):55

[6]李佐卿,谢东华,王宇,等.高效液相色谱荧光检测器快速测定水产品中的组胺[J].光谱实验室,2000,17(5):592-595

Rapid Detection Histamine Content in Aquatic Product Using Spectrophotometry

ZHAO Yu-ming
（Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian 116021，Liaoning，China）

Trichloroacetic acid was used to extract histamine in aquatic products then reacted with azo reagent and generated red compound.The absorbance was proportional to the histamine content in the samples and according to this I established a fast method of determination histamine in aquatic products.The detection limit was2.0μg/mL.The relative standard deviation（n=10）was 2.6% and the average recovery of histamine derivative（n=10）was 99.5%.The dependent coefficient of the linear function was 0.999 8 in the range of 0-40μg/mL.The results obtained by this method was rapid，stable.And the results were same with that obtained by Kjeldahlˊs method.

histamine；aquatic product；ultraviolet and visible spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.025

2013-11-15

赵宇明（1977—），男（汉），工程师，研究生，研究方向：分析化学。