8-异前列腺素F2α检测方法研究进展

陈文，马茹，梁若男，李成龙，余轩，王浩

（食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

8-异前列腺素F2α检测方法研究进展

陈文，马茹，梁若男，李成龙，余轩，王浩*

（食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

脂质过氧化（Lipid peroxidation，简称LPO）与很多衰老现象和疾病密切相关，对于脂质过氧化机理以及对其具有抑制功能的抗氧化剂的研究已成为食品和医药等领域的热点。8-异前列腺素F2α（8-iso-prostaglandinF2α，简称8-iso-PGF2α）是细胞膜上酯化的花生四烯酸被自由基催化后裂解所形成的前列腺素衍生物，是目前公认评价脂质过氧化反应的最有效生物标记物，因此，建立准确、可靠的8-iso-PGF2α的测定方法就显得尤为重要。本文就脂质过氧化、8-iso-PGF2α来源、标记功能等进行了概述，并对其测定方法进展进行了重点阐述，以期为该领域的研究工作提供参考。

8-异前列腺素F2α；测定方法；脂质过氧化；抗氧化剂

脂质过氧化是指脂类的多不饱和脂肪酸在自由基的引发下经酶促或非酶促作用，使其发生过氧化而生成脂质过氧化物的过程。目前国内外关于脂质过氧化、自由基损伤以及抗氧化剂的研究已成为食品、化妆品、生理学和流行病学等领域的热点。研究结果表明，脂质过氧化与很多衰老现象和疾病密切相关[1]。多不饱和脂肪酸在氧化过程中产生大量自由基和脂质过氧化物，引起机体代谢紊乱，并导致DNA、RNA、蛋白质、酶和生物膜的损伤，进而引发一系列疾病。据报道，目前危害人类健康的三大杀手——心血管、脑血管和癌症，其发病机制均与自由基引发的脂质过氧化反应有着直接的关系。而抗氧化剂可有效清除生物体内的自由基，进而起到保护人体细胞组织、心脑血管循环系统，抗癌及延缓衰老等生理作用。近年来，保健食品行业发展迅速，引起人们的广泛重视。在食品中添加具有清除自由基作用的功效成分，可有效清除体内的自由基，提高机体免疫力、抗衰老能力等，因此，脂质过氧化机理的深入研究对于相关疾病的预防、诊治以及筛选抗氧化保健食品功能材料，进而开发出具备抗氧化功能保健食品来抑制脂质过氧化的负面作用具有重要意义。

对于脂质过氧化机理的深入研究，首先要明确其状态的评价方法。目前评价脂质过氧化状态的方法一般可分为：脂质过氧化底物的测定和脂质过氧化产物两类，后者的应用较为广泛。脂质过氧化最重要的产物之一是丙二醛（MDA），在适当的条件下，它可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成一种红色物质，反应式见图1，该物质在532 nm处有一特征吸收[1]，据此可以测定MDA的含量，人们称此法为TBA反应物法。该法可用来指示脂质过氧化的程度[2]。

图1 硫代巴比妥酸法原理Fig.1 The principle of TBA method

硫代巴比妥酸法成本低廉、设备要求低，易于推广应用，因此，该法被广泛用于测定氧化应激的标志物MDA的含量以评估脂质过氧化的状态[3-4]。但由于专一性不好、灵敏度差，且生物体系中基质比较复杂，干扰物多，使得该法的应用受到严峻挑战[5]。Morrow等[6]报道了F2-异前列腺素（F2-isoprostanes）这一类化合物，它具有类似前列腺素F2α的复杂基团。8-iso-PGF2α是F2-异前列腺素的主要成分。8-iso-PGF2α的化学性质和产生过程均不易受外界环境的影响，是目前最新公认评价脂质过氧化反应最有效的生物指标之一[7-9]。这为寻找简捷、价廉、专一性好、灵敏度高及易于普及应用的方法进行脂质过氧化状态的评价奠定了基础。

1 8-iso-PGF2α概述

8-iso-PGF2α是自由基攻击细胞膜脂质花生四烯酸，使之发生过氧化反应后所形成的特异性终产物，其形成机制见图2。

图2 F2-异前列腺素的形成机制Fig.2 Mechanism of formation of F2-isoprostanes

1990年，Morrow等发现长期冷冻的血浆中8-iso-PGF2α的含量明显增加，同时他们还证实该过程是非酶催化的自由基攻击花生四烯酸的脂质过氧化反应。这种化合物是前列腺素的异构体，且均含有F型环戊烷，因此，被命名为F2-异前列腺素复合物（F2-ips）。根据F2-ips异构位点的不同，可分为VI、IV、V和III型[10]。F2-ips通过还原反应大部分生成F2-ip，同时还生成异血栓素、E2-ip、D2-ip、D2异缩酮、E2异缩酮等[11]。在体内F2-ips通过还原反应所形成的各种物质中，F2-ip的含量最为丰富，它也可分为iPF2α-III、iPF2α-IV、iPF2α-V、iPF2α-VI 4个亚型[12]，其中iPF2α-III是最具代表性的F2-ip，也称作8-iso-PGF2α或15-F2t-iP，其在F2-ip中所占的比例最大，存在于体液，如尿液、血液和脑脊液等以及肝、脑等组织中。

8-iso-PGF2α除具备诸如血管收缩剂、诱导内皮素释放和血管平滑肌细胞增殖、抗凝结以及介导炎症早期反应等生物活性功能外[13-15]，其作为评估脂质过氧化指标的功能更受到广泛关注。8-iso-PGF2α是花生四烯酸发生脂质过氧化反应的特异性终产物，且生成途径不依赖环氧化酶的催化，在机体组织上生成后释放到血液中，最终通过尿液排出体外，从生成到排出的整个过程不易受到药物或其他因素的影响[16]，因此，其在体液和机体组织中的含量非常稳定，能特异、灵敏地反映机体脂质过氧化的状态，被认为是评价脂质过氧化程度和损伤的最理想指标。

2 8-iso-PGF2α测定方法

8-iso-PGF2α以及其他F2-ip作为评价脂质过氧化反应的标志物，无论是体液如血液、尿液和胆汁中[17-18]，还是大脑、肝脏和脉管系统[19-21]等组织中的8-iso-PGF2的含量均已通过各种方法进行了测定。8-iso-PGF2α自发现以来，其测定方法主要有以下几种：

2.1 气相色谱-质谱联用测定法（GC-MS）

GC-MS法是测量8-iso-PGF2α最常用、最成熟的方法，该法具备较高的灵敏度和准确度，曾被认为定量测定F2-ips的参考方法（金标准）。电喷雾离子化技术（ESI）与质谱的结合大大提高了检测方法的灵敏度，此外，GC-MS-MS方法的高灵敏度和特异性，完全可以通过仅提取少量机体的组织或体液来定量测定其中8-iso-PGF2α的含量，从而直接评估机体的脂质过氧化情况。但该法对于样品的净化程度要求较高，一般需要通过固相萃取（solid phase extraction，简称SPE）或薄层色谱（TLC）来进行样品的净化。Liu Wei等通过C18SPE和SPE硅胶柱、薄层色谱技术来净化样品制备过程中的干扰基质[22]。Mas等也利用C18SPE柱和氨基SPE柱来净化尿液样品[23]。Chu等则集样品的净化和提取于一步，仅使用十八烷基键合硅胶SPE柱来净化血液样品[24]，并利用配备DB-5MS毛细管柱的Agilent GC-MS在选择离子模式下测定F2-异前列腺素的含量。因此，可以预见随着SPE新型填料的不断推出，SPE预处理样品技术将变得更为简便和高效。但是，对于GC-MS法测定8-iso-PGF2α来说，除了繁琐的样品预处理步骤外，还需要衍生化步骤、较高的设备要求以及需要专业人员进行操作都限制了该法推广应用。

最初，Morrow和Roberts应用GC-MS法，采用商品化的同位素标记的前列腺素F2α（PGF2α）做内标[25]测定了样品中总F2-ips（酯化的和游离的）的含量。但由于前列腺素的同位素标记物和其异构体的理化性质不完全相同，因此用同位素标记前列腺素来测定F2-ips的含量是该法的一个缺陷。目前市场上已有同位素标记8-iso-PGF2α的内标物出现，满足了内标物的要求。Liu Wei等以8-iso-PGF2α-d4为同位素内标（Cayman Chemical，Cat.No.316351），以C18SPE和硅胶SPE柱、薄层色谱为样品预处理技术，借助衍生化手段，应用GC-MS法测定了机体组织、血液和尿液中F2-ips的含量[22]，其GC-MS配备15m DB1701硅胶毛细管柱。考虑到尿液中内源性的化合物可能是同位素标记物8-iso-PGF2α-d4的共洗脱物，Mas等利用自己实验室合成的4（RS）-F4t-neuroprostane作为内标物，利用配备VF-1ms毛细管柱的GC-MS在NICI模式下测定了尿液中8-iso-PGF2α的含量[23]。该方法不但拓宽了GC-MS方法的应用范围，而且为复杂样品基质中8-iso-PGF2α含量的测定提供了思路借鉴。

2.2 高效液相色谱-质谱测定法（LC-MS/MS）

该法的特点是灵敏度较高，对样品的净化步骤要求不严，预处理简单、快捷，相对GC-MS法来说，又避免了繁琐的衍生化步骤。此外，该法能够同时测定多种异前列腺素，而免疫测定法每次只能测定一种。该方法也存在着灵敏度不如GC-MS的缺陷，但并不影响对于体液和组织中的8-iso-PGF2α含量的测定。

1996年，Murphy等报道首次使用该技术来测定异前列腺素的含量[26]，其主要仪器条件为：Ultracarb品牌的ODS 5μm，4.6 mm×25 cm分离柱，流动相为pH5.7的氢氧化铵和乙腈：甲醇（95∶5，体积比），配备三重四级杆MS进行目标物离子的监测。Taylor[27]等通过将SPE和液液萃取相结合，对传统的液液萃取方法进行了改进，同时他们还缩短了液相的分离时间以得到较高的峰高，两方面的改进提高了该法的灵敏度，最终测定了血浆中总15-series F2-isoprostanes的含量。Sicilia[28]等充分发挥该法对样品净化要求不严的优势，利用该法测定了CCl4所引发的脂质过氧化小鼠肝脏、肾脏和尿液中8-iso-PGF2α含量，为复杂生物基质样品中8-iso-PGF2α含量的测定提供了方法借鉴。近年来该法的应用次数呈快速增长的趋势[29-30]。可见，LCMS/MS是一种具备较好发展前景的检测技术。

2.3 免疫亲和色谱-气质联用测定法（Immuno-GC-MS）

免疫亲和色谱是利用抗体或者与抗体相关的材料作为固定相的色谱技术。抗体对抗原性物质的选择性结合使该技术越来越多地应用于生物物质以及非生物物质的分离、纯化和分析。其与GC-MS结合来测定8-iso-PGF2α含量的方法称为免疫亲和色谱-气质联用测定法。该法主要应用免疫亲和柱的净化作用和质谱的定量功能进行测定，其优点是免疫亲和柱可以重复利用，并可以代替所有的净化程序，但免疫亲和柱的寿命有限，需要不断地添加抗体。其一般测定程序是首先将待测样品通过免疫亲和色谱柱，其中待测目标物以及类似物与柱中的抗体结合，不与抗体结合的其他样品组分通过淋洗被除去。最后，将结合在固定相上的的待测目标物洗脱下来进GC-MS检测。Bachi等应用该方法测定了尿液中8-epi-prostaglandin F2α的含量[31]。

2.4 免疫测定法

免疫测定法（Enzyme Immunoassay，简称EIA）也称作酶联免疫测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）。与GC-MS法相比，该法简单、快速，不需专业人员操作。但该技术也存在着多种缺陷：一是准确性不好，在测定样品中8-iso-PGF2α之前，要对样品进行繁琐的纯化操作，这样不但费时，而且可能造成目标物的流失，导致低回收率；二是特异性差，可能发生交叉免疫反应，因为针对8-iso-PGF2α制备的抗体也可能与其他的异构体或其代谢产物发生交叉反应；三是结果误差大，在测定过程，尤其是在8-iso-PGF2α与抗体充分结合期间，样品中8-iso-PGF2α相关前体可以继续合成目标物，导致结果偏大。

目前，主要是基于该法的原理制备ELISA检测试剂盒，将其用于体内和体外8-iso-PGF2α的初步检测。在制备ELISA检测试剂盒用于8-iso-PGF2α测定时，利用GC-MS法进行了对比验证，但是并不意味着对于其他类型的异前列腺素及其代谢物也能够准确测定。总之，该法相对GC-MS法的优点是操作简单、不需要贵重仪器、成本较低和省时省力等。因此，可将该法用于对8-iso-PGF2α的含量的初检，如有必要再次通过GC-MS法进行验证，这种特点使其在医院中相关疾病的诊断和治疗方面应用较多。目前，用于8-iso-PGF2α检测的商业化试剂盒有北京西美杰科技有限公司推荐的OxiSelectTM8-iso-Prostaglandin F2αELISA Kit（8-isoprostane）试剂盒（目录号：STA-337），该试剂盒通过竞争性ELISA检测胞浆、尿液、血浆以及组织提取液等多种样品内的8-iso-PGF2α含量。在试剂盒中，还提供了8-iso-PGF2α标准样做标准曲线，并有相应的8-iso-PGF2α抗体和竞争性8-iso-PGF2α-HRP等。样品经ELISA反应后可在450 nm处读取数据并参照标准曲线计算出含量。该Kit可完成96次反应，操作简便、速度快。

3 结语

脂质过氧化产物和自由基能引起机体代谢紊乱，损伤DNA、RNA、蛋白质、酶和生物膜，并导致一系列疾病的发生。补充适当的外源抗氧化剂可有效降低或防止过氧化所导致的氧化损伤的发生，维持机体平衡和健康。抗氧化剂可分为两种：合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。前者主要是二丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚等，其生产工艺复杂，且有毒副作用，这些缺陷限制了其应用范围。天然抗氧化剂一般来源于植物，具有高效、低毒和功能齐全的优势，能够有效清除自由基、抑制过氧化，使氧化与抗氧化系统维持在平衡状态，是当前研究开发的重点。抗氧化剂抗氧化能力的评价方法有体内和体外抗氧化能力检测两种。建立脂质过氧化状态的客观评价方法，有助于对其机理的深入研究，不但可以指导如何有效规避脂质过氧反应带来的负面效应，而且可以作为评估抗氧化剂的效果的重要手段。脂质过氧化程度的检测方法除了常用的TBA反应物法测定MDA之外，本文综述了另一种方法，即通过测8-iso-PGF2α的含量来特异、稳定地反映脂质过氧化的程度。

8-iso-PGF2α作为脂质过氧反应的特异性稳定产物，是目前公认评价脂质过氧化反应状态的最有效生物指标。在8-iso-PGF2α的测定方法中，GC-MS法、LCMS/MS法、Immuno-GC-MS法和EIA法均有优势和不足，可根据实际情况进行选择。目前存在的问题是国内外没有针对8-iso-PGF2含量测定的统一的方法，不同方法之间的测定结果差距较大，导致测定结果难以对比。因此，建立一个公众认可的8-iso-PGF2α测定方法，显得较为迫切，也是下一步相关领域研究的重点和突破口。随着科技的不断发展，各种高新技术不断地应用于样品的预处理，这将会大大简化样品制备程序，提高检测结果的准确度和灵敏度，同时也将为建立公认的8-iso-PGF2α含量的测定方法提供技术支持。

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The Research Progress about Test Methods of 8-iso-prostaglandin F2α

CHEN Wen，MA Ru，LIANG Ruo-nan，LI Cheng-long，YU Xuan，WANG Hao*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Lipid peroxidation have close relationship with a lot of aging and disease，the study of mechanism of LPO and the antioxidant which have an inhibitory effect on，LPO has became a hat spot in food and medicine，et al.8-iso-PGF2αis a Prostaglandins derivative which is formed by pyrolysis of the esterification of arachidonic acid on the cell membrane.8-iso-PGF2αis currently recognized as one of the most effective biomarkers for the evaluation of LPO.Hence，the development of accurate and reliable method for the determination of 8-iso-PGF2αis very critical.LPO，the origin and function as a biomarker of 8-iso-PGF2αwere summarized in this article. Furthermore，the assay method for8-iso-PGF2αwere also highlighted reviewed so as to provide reference for the research work in this field.

8-iso-prostagland in F2α；assay method；Lipid peroxidation；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.031

2013-07-20

国家自然科学基金（31201322）；“十二五”国家科技计划（2012BAD33B05）；天津市高等学校科技发展基金计划（20100609）

陈文（1984—），男（汉），助理工程师，硕士，研究方向：食品营养与安全。

*通信作者：王浩（1979—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品营养学。