响应面法优化黑加仑籽油中γ-亚麻酸富集工艺

焦淑清，张萍，张云杰

（佳木斯大学药学院，黑龙江省生物药制剂重点实验室，黑龙江佳木斯154007）

响应面法优化黑加仑籽油中γ-亚麻酸富集工艺

焦淑清，张萍，张云杰

（佳木斯大学药学院，黑龙江省生物药制剂重点实验室，黑龙江佳木斯154007）

采用响应面优化尿素包合法富集黑加仑籽油中γ-亚麻酸的最佳工艺。在单因素试验基础上，选择包合温度、尿素/混合脂肪酸配比、95%乙醇/尿素配比（m L/g）、包合时间为考察因素，进行四因素三水平的Box-Behnken中心组合设计，采用响应面法分析4个因素对籽油中γ-亚麻酸含量的影响。结果表明，尿素包合法富集黑加仑籽油中γ-亚麻酸的最佳工艺为包合温度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1、95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g）、包合时间21 h，在此条件下，包合后籽油中γ-亚麻酸含量平均值为24.27%。

黑加仑籽油；γ-亚麻酸富集；尿素包合法；响应面分析法

黑加仑（Ribes nigrum L，black.currant）是虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子属（Ribes）一种浆果植物[1]。其果实常被制作成饮料，在黑加仑果中黑加仑籽占5%～8%[2]，在饮料等加工中产生了大量的黑加仑籽，其籽含油15%～20%，黑加仑籽油中γ-亚麻酸（Gamma Linlenic Acid，GLA）含量高达15%左右，是目前含有GLA最高的植物来源[3]。研究发现GLA对人体有多种药理作用[4]。研究从黑加仑籽油中富集GLA从而获得高含量的GLA是研究开发GLA制剂的前提。尿素包合法因其诸多优点而广泛用于各种不饱和脂肪酸的富集[5]。响应面优化法（Response Surface Methodology，RSM）是一种优化考察条件和加工工艺参数的有效方法[6]。利用响应面法优化尿素包合富集亚麻酸的研究已见报道[7-8]，利用此方法优化黑加仑籽油中γ-亚麻酸的富集工艺未见报道。本文采用超临界CO2萃取法与尿素包合法相结合从黑加仑籽中提取并富集GLA，采用气相色谱法（Gas-Chromatography，GC）测定GLA的含量，研究尿素包合中各影响因素对富集效果的影响，利用Box-Behnken响应面分析法优化尿素包合富集黑加仑籽油中GLA的工艺条件，为大规模利用黑加仑籽生产高含量GLA奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

超临界CO2萃取的黑加仑籽油（自制，γ-亚麻酸含量为15.21%）。标准品γ-亚麻酸甲酯（CDDE-U-63-M-100MG）：美国NU-CHEKPREP生产，购于上海安普科学仪器有限公司；高纯氮气（纯度≥99.999%）：佳木斯市东城制氧厂；其它试剂均为分析纯。气相色谱仪（型号7890A）：美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 混合脂肪酸的制备

准确称取超临界CO2萃取的黑加仑籽油10 g，置于三颈瓶中，加入NaOH（10%）11 mL、乙醇（95%）25mL，密闭、通入N2，在80℃下搅拌回流1.5 h.。旋转蒸除皂化液中的乙醇。趁热将除醇皂化液倒入一倍量的水中，用少量石油醚萃取不皂化物。在水层中加一倍量温水稀释，搅拌下滴加6mol/LHCl，酸化至pH= 2～3，静置分层。水层用石油醚萃取3次，合并醚层，再与油层合并，用5%NaCl水洗至中性，用无水硫酸钠干燥、抽滤，滤液旋转蒸发回收石油醚，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合富集GLA

尿素和乙醇（95%）按设定比例混合，置于三颈瓶中，在80℃下搅拌回流20min，待尿素全部溶解后滴加所制备的混合脂肪酸，密闭通入N2，在80℃下继续搅拌回流40min，倒出冷却后移至一定温度下包合一定时间。将包合物迅速抽滤，用温水洗涤滤饼，取滤液加少量稀硫酸破乳，用石油醚萃取3次，除水取有机层，用5%NaCl溶液洗至中性。加无水硫酸钠干燥、抽滤，滤液旋转蒸除石油醚，该滤液即为尿素非包合物，其中以GLA为主，即为包合后的黑加仑籽油。

1.2.3 分析方法

标准曲线制备：精密称取γ-亚麻酸甲酯对照品2.64mg，置于5mL容量瓶中，加正辛烷溶解成2.64mg/mL的对照液，配制浓度范围0.132mg/mL～0.792mg/mL。在此范围内线性关系良好，标准曲线方程为Y=727.73X-21.6（R2=1）。

色谱柱HP5（30m×0.25mm×0.25μm）；检测器：FID；分流比：30∶1；载气：高纯氮气；色谱柱温度：200℃（保持2min）210℃（保持5min）250℃（保持5min）；进样量：1μL。

样品处理：精密称取尿素包合前、后黑加仑籽油样品各60mg，置于10mL离心管中，加入2mL正辛烷溶解，再加5mL 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，摇匀，室温保持10min。加蒸馏水，如上层溶液混浊，加几滴无水乙醇可迅速澄清，取上层澄清液1μL进样分析，与对照品溶液对照，外标法定量。

1.2.4 响应面法实验设计

在单因素试验的基础上，采用Design Expert8.0.5.0统计软件，利用响应面法中box-behnken设计原理，以包合温度（℃）、尿素/混合脂肪酸（质量比）配比、95%乙醇/尿素配比（mL/g）和包合时间（h）为考察因素，每个因素取3个水平，以-1、0、+1编码，以富集产物中的γ-亚麻酸含量为响应值，进行实验设计，因素水平表见表1，试验设计见表2。

表1 响应面因素水平编码表Table1 Variables and leves in Box-Benhnken CCD

表2 响应面试验设计及结果Table2 Box-Benhnken CCD matrix and experimental values of γ-linolenic acid content

2 结果与讨论

2.1 响应面分析结果

按表1因素及水平表设计的响应面分析方案进行实验的结果见表2。

表2中，试验号1～24是析因实验，实验号25～29是中心实验，29个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

2.2 实验数据分析

实验数据分析采用Design Expert8.0.5.0软件进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到以γ-亚麻酸含量为目标函数，关于各条件编码值的二次回归方程为：Y=+29.43+0.95X1+0.030X2-0.84X3+0.061X4-0.43X1X2+0.84X1X3-0.048X1X4+0.037X2X3-0.40X2X4-0.58X3X4-2.30X12-2.27X22-1.66X32-1.26X42

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程方差分析表Table3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

由表3可知，一次项中X1、X3的偏回归系数极显著，说明包合温度和95%乙醇/尿素的配比对黑加仑籽油的富集有极显著影响；X1X3项的偏回归系数达高度显著水平，X3X4项的偏回归系数达显著水平；二次项中X12、X22、X32、X42的偏回归系数达极显著水平。

2.3 交互作用分析

各因素及其交互作用对γ-亚麻酸含量的影响见图1。

从图1可以分析得出，对于包合温度（A）、尿素/混合脂肪酸（B）、95%乙醇/尿素（C）、包合时间（D）四因素，γ-亚麻酸的含量均随各因素值的增大先增大后减小，其中影响幅度A＞C＞B＞D。此外从各图还可以分析得出包合温度与95%乙醇/尿素配比、包合时间与95%乙醇/尿素两两间交互作用明显，其余因素间交互作用不明显。

图1 各因素及其交互作用对γ-亚麻酸含量的影响Fig.1 The effect of factors and their interacion of γ-linolenic acid content

2.4 工艺条件的确定

为得出最优提取工艺条件，将回归模型取一阶偏导令其等于零，解关于X1、X2、X3、X4的三元一次方程组，变换成真实值可得包合温度-20℃、尿素/混合脂肪酸（质量比）配比为3.5∶1、95%乙醇/尿素（mL/g）配比为2.5∶1、包合时间为20.9 h，在此条件下GLA的理论值为24.36%。为了实际操作可行，将理论优化包合工艺参数修正为包合温度-20℃，尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1，95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g），包合时间21 h。在此条件下平行进行包合实验3次，实际测得的平均γ-亚麻酸含量为24.27%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.369 4%，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的可靠性。

3 结论

尿素包合富集黑加仑籽油的最佳工艺条件为包合温度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比为3.5：1、95%乙醇/尿素配比为2.5：1（mL/g）、包合时间21 h，在此条件下黑加仑籽油中γ-亚麻酸的含量为24.27%，比包合前（15.21%）提高了59.57%。响应面分析法适用于对超临界CO2萃取的黑加仑籽油进行尿素包合富集γ-亚麻酸的参数优化，本研究对大规模利用黑加仑籽生产高含量GLA具有一定的指导意义。

[1]赵丽岩,杨忠生,汤建杰.黑加仑栽培技术[J].北方园艺,2005(9): 50-51

[2]肖辉,张月明,冷爱枝,等.黑加仑提取物抑制肿瘤生长及其抑制研究[J].毒理学杂志,2007,21(2):132-134

[3]吕薇,蒋剑春,徐俊明.尿素包合法纯化小桐子油多不饱和脂肪酸的工艺[J].化工进展,2011,30(6):1213-1218

[4]王世磊.Design-Expert软件在响应面优化法中的应用[D].郑州:郑州大学,2009:1-17

[5]欧阳辉,余佶,陈功锡,等.超临界CO2萃取花椒籽油工艺的响应面优化[J].中国油脂,2009,34(10):9-12

[6]许辉,孙兰萍,张斌,等.超临界CO2萃取杏仁油的响应面优化[J].中国粮油学报,2008,23(1):93-97

[7]吴彩娥,许克勇,李元瑞,等.尿素包合法富集猕猴桃籽油中α-亚麻酸[J].农业机械学报,2005,36(5):56-60

[8]杨万正,关奇,蓝荣.尿素包合法富集葵花油中亚油酸的研究[J].中国中医药信息杂志,2007,14(5):50-52

Optimization ofγ-linolenic Acid Enrichment Technology from Blackcurrant Seeds Oil by Response Surface Methodology

JIAO Shu-qing，ZHANG Ping，ZHANG Yun-jie
（College of Pharmacy，Jiamusi University，Heilongjiang Province Key Laboratory of Biological Medicine Formulation，Jiamusi154007，Heilongjiang，China）

The present study aimed to optimize enrichment ofγ-linolenic acid from blackcurrant seeds oil using urea inclusion method and response surface methodology（RSM）combined with a 4-variable，3-level Box-Behnken central composite design（CCD）on the basis of single factor experiments.Inclusion temperature，ratio of urea-to-fatty acid，ratio of 95% ethanol-to-urea（mL/g）and inclusion time were studied.Results showed that the optimized enrichment conditions are inclusion temperature-20℃，urea-to-fatty acids ratio 3.5∶1，95% ethanol-to-urea ratio2.5∶1（mL/g）and inclusion time21 h，resulted in a average γ-linolenic acids of seeds oil yield of up to24.27%.

blackcurrant seeds oil；γ-linolenic acid enrichment；urea inclusion method；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.013

2013-08-28

本研究项目为佳木斯市2011年度重点科研课题（NO.11097）

焦淑清（1960—），女（汉），教授，本科，从事制药工程教学和科研工作。