川渝部分地区仔猪源大肠埃希菌的血清型鉴定及耐药性监测

舒 蕾，张曼丽，刘 杰，潘海波，刘 丹，张 勇，颜其贵，3

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川 雅安625014；2.重庆太极药用动植物资源开发有限公司，重庆涪陵408000；3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安625014）

大肠埃希菌也称大肠杆菌，在畜牧生产中常引发猪大肠杆菌病，大肠杆菌病也是人畜共患的肠道细菌性传染病，主要有仔猪黄痢、仔猪白痢及仔猪水肿等在规模化猪场中发病率和死亡率均较高，严重影响养猪业的健康发展。因大肠埃希菌的血清型众多，变异较大，滥用抗生素易诱发和传播耐药菌的特点[1-2]，使得大肠杆菌病防治十分困难。本试验随机采集川渝地区43个规模化猪场的仔猪腹泻性病料，进行血清型鉴定及耐药性监测，旨在掌握各区域大肠埃希菌的流行血清型和耐药性发展现状，为制定治疗方案和防制措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 2011年11月-2012年5月，在川渝地区对随机选择的43个规模化猪场进行病料采集。

1.1.2 主要试剂 麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、细菌生化鉴定管和药敏纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；MH培养基，购自英国OXOID公司；50种大肠埃希菌属诊断血清，购自天津生物芯片技术有限责任公司；药敏质控菌株标准株ATCC 25922，购自中国兽医药品监察所；其他试剂实验室制备。

1.1.3 试验仪器 仪器均为常规设备。

1.2 试验方法

1.2.1病料采集 调查走访川渝18个地区的43个规模化猪场，根据流行病学调查后采集仔猪腹泻发病猪的新鲜粪便合计300份，具体采集、保存方法参照文献[3]进行。

1.2.2 细菌分离纯化 取病料于麦康凯平板上划线接种，37℃，培养18 h，挑取单个粉红色菌落接种于伊红美蓝平板纯化，37℃，培养18 h，挑取有紫黑色带金属光泽的单个菌落进行染色镜检，将符合大肠埃希菌镜检特征的接种于营养肉汤中，37℃摇床扩大纯培养。

1.2.3 生化鉴定 取纯化后新鲜菌液分别接种TSI和细菌生化鉴定管，方法及判定结果参考文献[4]进行。

1.2.4 血清型鉴定 将鉴定为大肠埃希菌的菌株进行玻片凝集试验，方法及判定结果参照血清诊断试剂盒说明书进行。

1.2.5 耐药性监测 对鉴定为大肠埃希菌的菌株进行药敏试验，药敏质控参照标准株ATCC 25922进行，试验采用美国临床实验室标准委员会CLSI[5]推荐的K-B法进行，结果判定依据杭州天和微生物试剂有限公司药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准进行。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定 280份病料中分离出273株大肠埃希菌，分离率为97.5%，273株大肠埃希菌的TSI及生化试验结果均符合肠杆菌科细菌生化鉴定特征，即TSI出现斜面底层变黄、有气体；生化鉴定分离菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、木糖，产酸产气，少数能发酵蔗糖，M.R试验、吲哚试验为阳性，尿素酶、枸橼酸盐、柠檬酸盐、V-P试验为阴性。

2.2 血清型鉴定 273株菌株中有205株定型，定型比例为75.09%。血清定型分别属于：O1、O2、O6、O7、O8、O9、O11、O15、O18、O20等43个不同血清型，其中O138检出率最高，为12.2%，其次是O20（6.83%）、O8（6.34%）、O60（5.85%）、O141（5.85%），共占定型比例为75.09%。

2.3 药敏试验

2.3.1 药敏结果 16种临床常用抗菌药物中抑菌作用最强的为丁胺卡那霉素、头孢他啶，敏感菌株分别占53.11%、49.45%，对氨苄西林、磺胺嘧啶、四环素呈高度耐药，耐药率均在80%以上，对其他药物也表现出不同程度耐药，结果见表1。

表1 273株大肠埃希菌对14种抗菌药物的耐药性

2.3.2 耐药谱分析 对多重耐药性分析结果（图1）表明：试验菌株对所试14种药物表现出严重的多重耐药，大部分菌株对5种及以上耐药，总比例占86.45%，最高达14耐，大部分呈7耐、8耐及12耐，比例为35.53%，273株大肠埃希菌共有142种耐药谱型。

图1 大肠埃希氏菌对常用抗菌药物的多重耐药谱

3 讨论与分析

3.1 仔猪常因饲养管理不良，卫生条件差，环境温差变化等综合应激因素引起仔猪抵抗力降低而诱发腹泻。所以，针对规模化猪场应改善饲养管理，减少应激发生；产前母猪可进行疫苗免疫，通过泌乳使仔猪获得母源抗体；积极进行药物敏感性监测，选择有效抗菌药物预防；加强环境消毒，防止耐药菌株的交叉传播和感染；选择使用黄芪多糖等，增强动物机体抵抗力，减少疾病发生；运用微生态制剂改善肠道微环境，避免正常菌群发生紊乱。

3.2 大肠埃希菌血清型较多是导致临床采用商品细菌疫苗防疫效果不佳的主要因素之一。国外已有报道过主要流行血清型，如O8，O9，O20，O45、O64，O101，O138，O139，O141，O147，O149和O157等[6]，在本次调查中273株大肠埃希菌分属43种血清型，其中O138、O20、O8、O60、O141、O7、O38检出率较高，共占46.83%（96/205）。本次试验结果与上海地区优势血清型（O149、O111和O60）[7]、广东省优势血清型（O8、O64）[8]、重庆市优势血清型（O101、O8、O20、O64、O45和O149)[9]、四川及广西地区优势血清型（O8、O20、O60、O98、O141、O138和O139）[10]相比较得出，同一时期不同地区、同一地区不同时期优势血清型也具有较大差异。本次试验的鉴定结果，有助于掌握本地区大肠埃希菌血清型流行状况，为更好防控提供科学依据。

3.3 对273株大肠埃希菌的耐药性监测结果为：氨苄西林、磺胺嘧啶、四环素这几类抗菌药物存在高耐药性，耐药率均超过90%，丁胺卡那霉素及头孢他啶是较为敏感的药物，其他药物存在不同程度的耐药；这与李金良等[11]报道的西南地区规模化猪场大肠埃希菌的耐药性具有一致性，其中庆大霉素(67.77%)、头孢唑啉（51.65%）、丁胺卡那霉素（30.04%）的耐药率较田国宝等[10]报道的四川地区和魏雅静等[12]报道的西南地区有明显的增高；头孢唑啉的耐药状况较孙晓锴[9]报道的重庆地区也有明显的加剧；86.45%的试验菌株至少对5种药耐药，猪源大肠埃希菌呈多重耐药现象，同等耐药程度的分离菌有多种耐药谱型，耐药谱型在增宽，这同林居纯等[13]对我国不同地区大肠埃希菌有多重耐药的结论一致。

耐药性监测的结果真实反应了川渝各地域猪场在抗菌药物的使用上具有一致性，临床不合理或滥用抗菌药物有利于耐药菌的筛选和扩散，给兽医工作者带来巨大考验。此次对四川和重庆地区猪源大肠埃希菌的耐药性监测结果为临床防治大肠杆菌病有着重要的参考意义。

3.4 近年来，“超级细菌”、“速成鸡”的出现，是对畜牧行业的警钟和巨大考验。选择“绿色治疗”细菌性疾病是行业之福、民心所向。中药为天然植物，具有残留低、毒副作用小、药效时间长、不易产生耐药性等优点，中兽药在兽医临床施药中越发具有优势，其疗效也被公众所认可，刘玉芹等[15]用板蓝根、连翘、败酱草等及其复方配伍可以有效治疗仔猪大肠埃希菌性腹泻；另外，国内外已有利用噬菌体治疗大肠杆菌病，并取得较好疗效[15-16]。噬菌体作为天然抗菌制剂，可以感染并裂解相应的细菌，具有不良反应小、不易产生抗药性、无残留、低成本等优点[17]，因而，噬菌体有望成为抗生素的替代品在临床中得以应用。因此，中兽药的运用和噬菌体制剂的研发为大肠埃希菌的耐药问题打开了另一扇窗。

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