下调miRNA-155 对糖尿病加重脑缺血损伤的影响

韩江全，卢俊江，向灿辉，刘承灵，王正远，刘 玲，陈 玲

脑梗死是糖尿病的严重血管并发症，糖尿病合并急性脑梗死占脑梗死的20%～25%，且梗死面积更大、症状更重，更容易形成进展性卒中，预后更差［1，2］。目前对糖尿病性脑梗死仍未寻找出有效可行的治疗措施。miRNAs 是一类小分子非编码RNA，约由20～22 个碱基组成。有研究结果显示，miRNAs 可通过调控其靶mRNA 翻译过程发挥基因表达调控作用，从而广泛参与细胞分化、增殖以及凋亡等多种生物现象［3］。有研究结果显示，脑缺血损伤后，以及在多种脑损伤同时存在的情况下，miRNA-155s 表达呈现显著变化［4，5］，提示miRNA-155在脑缺血损伤中发挥重要的调控作用。miRNA-155具有多种生物学功能，抑制miRNA-155 具有神经保护作用，对脑缺血损伤有益［5，6］。我们通过使用人工合成miRNA-155 抑制物下调糖尿病大鼠脑缺血侧皮质组织内miRNA-155 水平，观察miRNA-155 对糖尿病大鼠脑缺血损伤的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD 大鼠购买自遵义医学院珠海校区实验动物中心。RNA 抽提试剂盒miRNeasy Mini 购买自Qiagen 公司;TaqMan®MicroRNA 反转录试剂盒、TaqMan®基因表达预混液以及TaqMan®MicroRNA Assays 购自Applied Biosystems by Life Technologies 公司;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂购自Sigma 公司;链脲佐菌素(STZ)购自Sigma 公司;TNF-α 羊抗多克隆抗体购自Santa Cruz公司;miR-155 抑制物及阴性对照核苷酸购自上海吉玛生物公司。miR-155 抑制物及其阴性对照核苷酸均溶解于灭菌生理盐水中，浓度为0.2 g/L。

1.2 模型的制备

1.2.1 糖尿病动物模型建立 STZ 用0.1 mmol/L 柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.2)在冰浴中配制10 mg/L 浓度。禁食8 h 大鼠于左下腹腹腔注射STZ 55 mg/kg。用罗氏血糖仪测定大鼠尾尖血血糖，稳定7 d 后。症状表现为多饮、多食、多尿，空腹血糖＞16.7 mmol/L 的大鼠确定为糖尿病大鼠。

1.2.2 永久性局灶性脑缺血模型的建立 采用Longa 线栓法建立永久性大脑中动脉阻塞脑缺血模型，均予阻断右侧大脑中动脉24 h。糖尿病大鼠于注射STZ 后6 w 进行。

1.3 实验动物分组 实验动物60 只，周龄8～12 w，体重240～280 g，均衡饲料喂养，自由进食。随机分为6 组:(1)假手术组(sham 组):不阻断右侧大脑中动脉，于脑缺血5 min 时经侧脑室注射等容量生理盐水;(2)脑缺血组(CI 组):于脑缺血5 min 时经侧脑室注射等容量生理盐水;(3)糖尿病脑缺血组(DCI 组):糖尿病大鼠于脑缺血5 min 时经侧脑室注射等容量生理盐水;(4)糖尿病脑缺血+miRNA-155 抑制物组(inhibitor 组):糖尿病大鼠于脑缺血5 min 时经侧脑室注射miRNA-155 抑制物10 μg;(5)糖尿病脑缺血+阴性对照组(scramble组):糖尿病大鼠于脑缺血5 min 时经侧脑室注射miRNA-155 阴性对照核苷酸10 μg;(6)糖尿病脑缺血+生理盐水组(NS 组):糖尿病大鼠于脑缺血5 min 时经侧脑室注射等容量生理盐水。每组均10只大鼠。

1.4 神经功能评分 参照Zea-Longa 5 分制评分标准，于缺血24 h 对各组大鼠进行行为学评分纪录。2 分或2 分以上者为造模成功。

1.5 梗死体积测定 各组动物在脑缺血后进行过量麻醉处死，迅速断头取脑，放入冷冻冰箱冻至适当的硬度，以前额极起行冠位切片，每2.0 mm 切一片，每只大鼠大脑大约切4～6 片，置于2% 氯化三苯基四氮唑生理盐水中，37 ℃孵育15～30 min，正常脑组织呈深红色，梗死灶呈白色，在手术照射灯下拍照，结合计算机图像分析仪测出梗死灶体积。

1.6 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miRNA-155 表达 脑缺血3 h 后，取大鼠脑皮质区组织标本。使用miRNeasy Mini 试剂盒提取总RNA。根据TaqMan®MieroRNA 反转录试剂盒使用说明将RNA 样品逆转录。将获得cDNA 稀10 倍后使用TaqMan®MicroRNA Assays 及TaqMan®基因表达预混液进行Real-Time PCR 反应。采用U6 为内参基因。通过2-ΔΔCT 法统计各组间miRNA-155 相对表达量。

1.7 免疫组化检测TNF-α 表达 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC)法，按照TNF-α 免疫组化染色试剂盒说明书进行操作。阴性对照，一抗采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替。各组实验动物一起切片，并同时进行免疫组化染色，以确保条件的一致性。光镜下观察各组大鼠皮质缺血半暗带区域TNF-α 阳性细胞(细胞核中有棕黄色颗粒为阳性细胞)的表达变化。用MiVnT 显微生物图像分析系统进行免疫组化图像定量分析，所测得的阳性细胞平均灰度值(average grey level)表示TNF-α 阳性表达信号的相对强弱。平均灰度值越小，表示染色越深，TNF-α 的表达也就越强。在每个标本的缺血周围区随机测量5 个不重叠视野，每个视野又选取5 个阳性细胞测量平均灰度，取其平均值代表此例标本该区域的平均灰度值。

1.8 Western blot 检测TNF-α 表达 大鼠迅速断头取脑，冰上分离缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，冰上研磨组织后加预冷的蛋白裂解液，继续碾磨至液态，然后4 ℃，12000 r/min 离心30 min，留上清液，取40 μl 用BCA 法进行蛋白定量测定，所剩上清液按4∶1 的比例加变性loading，100 ℃水浴10 min。取蛋白样品(40 μg)采用10% SDSPAGE100V 垂直电泳(Bio-Rad 垂直板式电泳槽仪，USA)120 min 进行分离，然后转至硝酸纤维素膜(PVDF)上进行免疫反应(200 V，120 min)。5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，然后加入兔抗TNF-α 抗体(1∶500)，37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜;偶联辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG(稀释浓度1∶2000)室温孵育2 h，LumiGLO(20×)发光剂中X-感光盒内曝光。以上反应均在塑料袋内进行，其间用PBS 充分洗涤。为了检测蛋白裂解/转移的变化，所有的印迹均以丽春红(抗体孵育前)和考马斯亮蓝(化学发光法检测后)染色。将胶片进行扫描或拍照，采用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理图文分析系统进行图像分析，获取各组Western blot 条带的平均吸光度(A)值，内参为β-action，目的蛋白与β-action 吸光度比值即为目的蛋白的相对值。

1.9 统计学处理 采用SPSS17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组造模前血糖值 Sham 组为(5.78±0.32)，CI 组为(5.90±0.27 mmol/L)，DCI 组为(16.96±1.65 mmol/L)，Inhibitor 组为(16.93±1.15 mmol/L):Scramble 组为(16.97±1.53 mmol/L)，NS 组为(16.92±1.43 mmol/L)。DCI 组、Inhibitor 组、Scramble组及NS 组的血糖水平明显高于CI 组，有显著统计学意义(P＜0.05)，而DCI 组、Inhibitor 组、Scramble 组与NS 组4 组间无明显统计学差异(P＞0.05)。

2.2 miRNA-155 抑制物下调miRNA-155 表达效果 Real-time PCR 结果显示，侧脑室注射miRNA-155 抑制物显著下调糖尿病大鼠脑缺血侧皮质区miRNA-155 表达水平。而Scramble 组及NS 组miRNA-155 表达水平无显著改变(见表1)。

2.3 神经功能缺损评分 Sham 组未见神经功能缺损，其余各组大鼠在麻醉清醒后均出现不同程度的神经功能缺损。使用miRNA-155 抑制物下调miRNA-155 表达水平后，糖尿病脑缺血大鼠的神经功能缺损评分较DCI 组显著减少(P＜0.05)，Scramble 及NS 对糖尿病脑缺血大鼠的神经功能缺损评分无显著影响(见表1)。

2.4 梗死体积 Sham 组未见有白色梗死区域，其余各组脑缺血侧可见到明显的白色梗死区。使用miRNA-155 抑制物下调miRNA-155 表达水平后，糖尿病脑缺血大鼠的梗死体积较DCI 组显著减少(P＜0.05)，使用Scramble 及NS 后对糖尿病脑缺血大鼠的梗死体积无显著影响(见表1)。

2.5 TNF-α 表达Sham 组有少量TNF-α 表达其余各组缺血侧顶叶皮质TNF-α 表达明显增多。使用miRNA-155 抑制物下调miRNA-155 表达水平后，糖尿病脑缺血大鼠的TNF-α 表达较DCI 组显著减少(P＜0.05)，使用Scramble 及NS 后对糖尿病脑缺血大鼠的TNF-α 表达无显著影响(见表1)。

表1 各组大鼠神经功能评分、脑梗死体积、miRNA-155 及TNF-α 表达水平比较(±s，n=10)

表1 各组大鼠神经功能评分、脑梗死体积、miRNA-155 及TNF-α 表达水平比较(±s，n=10)

与Sham 组比较aP＜0.05;与CI 组比较bP＜0.05;与DCI 比较cP＜0.05

3 讨论

糖尿病是脑血管病发病加重的重要危险因素，它不仅能够诱发脑缺血，而且能够使脑缺血损伤进一步加重。本实验发现，与脑缺血组相比，糖尿病脑缺血大鼠的神经功能评分明显增加，梗死面积显著增大(P＜0.05);从行为学及形态学方面进一步证实了糖尿病可加重脑缺血损伤，与既往研究报道［1，2］一致，提示糖尿病对缺血性脑损伤有加强效应。目前对糖尿病性脑梗死仍未寻找出有效可行的治疗措施，深入研究糖尿病加重脑缺血的病理机制，探寻有效可行的治疗措施及其治疗靶点具有重要现实意义。

miRNA 是一类进化上保守的非编码单链小RNA，长19～24 个核苷酸，能在转录后降解靶基因mRNA 或抑制基因的翻译。每一种miRNA 可以通过调控多个靶mRNA 表达，对生物体的基因表达调控发挥着极其广泛的作用［3］。尽管miRNA 调控着机体一些生理状况及疾病的发生发展，一些研究也显示miRNA 在神经元死亡与变性中的意义［7］。近年来通过分析脑缺血模型miRNA 的表达模式，脑缺血损伤后miRNA 的表达变化以及miRNA 调控缺血损伤的神经保护作用已逐渐被揭示。已经证明，miRNA 参与调控脑缺血病理生理过程的多个环节，拮抗某些miRNA 具有神经保护作用［8，9］，但有关miRNA-155 在糖尿病加重脑缺血损伤中的作用迄今尚未见报道。

miRNA-155 是近年来研究揭示的，位于人类21号染色体上Bic 基因的第3 个外显子内，为外显子中一段138 个核苷酸保守序列编码miRNA-155 的前体发夹结构。成熟miRNA-155 序列为:5 ’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3 ’。miRNA-155主要来源于活化的淋巴细胞及单核巨噬细胞内高表达的非编码转录产物，通过调控相关靶基因的表达而参与多种病理生理过程［10］。研究发现，永久性大脑中动脉阻塞模型其海马区及外周血中miRNA-155表达出现显著改变［4］;新近研究在其大脑皮质区亦可见miRNA-155 表达明显上调［5］。而在多种脑损伤同时存在的情况下，miRNA-155 等miRNA 在脑组织中的表达亦会有显著的改变［4］。本实验结果显示，与脑缺血组相比较，糖尿病脑缺血组大鼠皮质区miRNA-155 表达明显上调，一方面提示miRNA-155表达具有广泛性及作用机制的复杂性;另一方面也表明miRNA-155 可能参与了糖尿病加重脑缺血损伤的病理生理过程。

糖尿病加重脑缺血损伤过程是脑缺血与糖尿病共同作用的结果，其机制与炎症反应以及免疫密切相关［1，2］。其中，炎症因子的激活及其释放在炎症过程中扮演着重要的角色，构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础［11］。高血糖、脑缺血及再灌注损伤可引起细胞炎症因子TNF-α、IL-1β 等的表达，影响炎症级联反应，放大炎症效应，最终导致脑损伤加重［12］。而miRNA-155 具有促炎性作用，与脑缺血后炎性反应密切相关［5，13］。神经小胶质细胞在脂多糖刺激后，miRNA-155 表达明显上调;敲除miRNA-155后，则细胞因子信号1 抑制蛋白(SOCS-1)显著上调，一氧化氮产生以及炎症细胞因子、诱导一氧化氮合酶表达明显减少;原代培养神经元在miRNA-155 被抑制的条件培养基进行培养，则减少神经元死亡［5，6］。此外，与野生型小鼠相比，miR-155 基因敲除小鼠给予LPS 注射后，血浆中TNF-α 的水平较低;相反，在高表达miR-155 的转基因小鼠中，给予LPS体内注射后，血浆中TNF-α 的水平则远比野生型小鼠高［14，15］，而抑制miR-155 的表达可削弱LPS 诱导的巨噬细胞炎症应答，减少TNF-α 等炎症介质的生成［16］，因此，抑制miRNA-155 表达可能具有神经保护作用，对脑缺血损伤产生有益作用［5，6］。本实验结果发现，与脑缺血组相比较，糖尿病脑缺血大鼠TNF-α 及miRNA-155 表达明显上调，神经功能评分明显增加，梗死面积显著增大;而抑制miRNA-155 表达，则TNF-α 表达明显下调，糖尿病脑缺血大鼠的神经功能评分显著减少、梗死面积减小，这一方面提示miRNA-155 对糖尿病加重脑缺血损伤有着重要的调控作用;另一方面提示miRNA-155 有可能成为治疗糖尿病脑梗死新的靶点。

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