从青霉素的发现与应用谈研究生科研提问能力的培养

刁宗平，章建全

(第二军医大学 附属长征医院超声医学教研室，上海 200003 )

从青霉素的发现与应用谈研究生科研提问能力的培养

刁宗平，章建全

(第二军医大学 附属长征医院超声医学教研室，上海 200003 )

研究生在获得专业知识的同时，还需要结合文献阅读提出新的科研问题，并设计实验方案来解决提出的问题。本文作者以青霉素的发现、制备、应用为案例进行教学，浅析如何提出问题以及提出问题所用的思维方式，以启发研究生运用求异和置换的思维方式来提出新颖的科研问题，并设计实验来回答提出的问题，从而为研究生完成学术论文奠定良好的基础。

青霉素；案例教学；求异思维；置换思维

中国有句古话：“读万卷书，行千里路”，然而多数学生即便读了万卷书，却没能行上千里路！换句话说他们不缺知识，缺的是创造新知识、新方法的能力。综合分析，这种死读书、少创造的重要原因之一可能是我国的教育模式没有能够帮助学生塑造起创新的思维。多少年来，应试教育强调的是统一，灌输的是知识，赞扬的是分数，而忽略的是个性化的创新思维，湮没的是独立思考的意识，由此以来教师的问题便是学生的问题，教师不提问题学生自己便提不出问题。如何在现有的教育大氛围中让不会提问题的研究生，改变过去的思考方式，提出一个新颖的科研问题，就成为研究生完成学术论文、进行科研选题的关键。本文以青霉素为案例教学，谈谈其发现过程；在其发现及应用过程中是如何提出问题；以及提出新问题所用的思维方式；并就如何提出问题给出了一些建议。

1 青霉素的发现及应用过程

青霉素(penicillin, PCN)是一种能破坏细菌细胞壁，在繁殖期起杀菌作用的抗生素，可在青霉菌培养液中提取。合成后的青霉素可以对抗更多类型的细菌，扩大了抗菌谱，改善了耐药问题。Alexander Fleming、Howard Walter Florey和Ernest Boris Chain因对它的研究，在1945年共同获得了诺贝尔医学奖和生理学奖。

首先是1928年，Alexander Fleming[1]发现一种霉菌可生产某种对葡萄球菌有害的物质，后证明了这种物质能抑制许多其它有害细菌的生长，将其命名为青霉素。但是，青霉素可以用于人体以灭菌吗？怎样能获得大量的青霉素？Fleming不清楚。这个问题成为Howard Walter Florey和Ernest Boris Chain的研究方向。终于在1942年，他们在美国找到了大量生产、分离、纯化出青霉素的方法，同时还发现了青霉素可以用于小白鼠以抗菌，随后广泛用于人类[2]。那么青霉素菌灭菌的作用机制是什么？

1950年，Park及其同事在进一步的研究中，则观察到受抑制的葡萄球菌累积了尿核苷，推测这是由于青霉素阻断了细菌细胞壁合成的某一步。1957年，人们阐明了粘肽的结构及其生物合成，并确定了青霉素是阻断了粘肽生物合成的最后一步(转肽反应)，1972年，Sujinaka首先报道了细菌的细胞膜上有特殊的蛋白质分子，被称之为青霉素结合蛋白(Penicillin Bonding Proteins，PBPs)，当时发现它能和青霉素共价结合而得名，后来研究发现PBPs也能与非β2内酰胺类抗生素结合[3]。近年来的研究发现，它为4万-12万的膜蛋白，具有很高的转肽酶和羟肽酶活力，是在细菌生长过程中起重要作用的蛋白质，同时也是青霉素类抗生素抑制作用的靶蛋白。青霉素作为PBPs底物的结构类似物，竞争性地与酶活性位点共价结合，从而抑制PBPs，干扰细菌细胞壁的合成，以达到杀灭细菌的作用。主要机制是：青霉素含有高活性β-内酰胺环，与连接MNAC的五肽的最后二肽(即D-丙氨酰-D-丙氨酸)结构相似，转肽酶与β-内酰胺环的酰胺键共价结合，形成乙酰化转化酶，使转肽作用不能进行，交叉联结受阻，致细胞壁缺损，而失去保护屏障。由于菌体内渗透压高，在等渗环境中水分不断渗入，致细胞肿胀、变形，在自溶酶激活影响下，细菌破裂溶解而死亡。至此，青霉素灭菌的作用机制已经研究清楚。

然而，随着青霉素类抗生素的广泛应用，细菌耐药性的问题逐渐显现，研究发现PBPs介导的细菌对青霉素类抗生素的耐药性与其基因结构发生改变有重要关系。那么青霉素结合蛋白的基因序列如何？它对细菌耐药性有无影响？最早Spratt和Pardee用聚丙烯酰胺凝胶电泳法( polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE )分离出PBPs的编码基因，并按分子量大小分为高分子量A类、高分子量B类和低分子量三种类型。现在人们用分子动力学模拟，量子力学及X-射线衍射等方法进一步研究了PBPs的晶体结构，活性位点的氨基酸序列及抗生素与PBPs具体酰化步骤。目前已搞清楚金黄色葡萄球菌的PBP2a晶体结构是由三部分组成：①N-末端跨膜区；②糖基转移酶区；③转肽酶区，含β-内酰胺类抗生素作用位点[4]。如果这些保守序列或相邻的氨基酸被替代，β-内酰胺类抗生素不能有效地与PBPs结合而导致耐药。从此，青霉素结合蛋白成为细菌耐药性研究的热点，明确了PBPs的数量和种类或者与抗生素的亲和力发生变化，都会影响细菌的形态和对抗生素的敏感性．从而产生耐药性。

2 青霉素的发现及应用过程中提出的问题

从PCN的发现及应用过程可以看出，每一个研究都引出了一个新的问题。即：在发现青霉素可以抑制金黄色葡萄球菌生长以后，引出的问题是：它可以在动物上发挥作用吗？怎样才能大量生产？从发现可用以人类抗菌及可以大量提纯、生产以后，引出的问题是：青霉素抗菌的作用机制如何？在发现了青霉素可以阻碍细菌细胞壁合成以后，引出的问题是：它如何阻碍细胞壁的合成？研究发现某些细菌细胞壁上存在青霉素结合蛋白(PBPs)，它可以通过转肽作用合成细胞壁，作为靶器官，青霉素与之结合，导致细胞壁不能正常合成而缺失。随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性问题逐渐增多，引出的问题是：PBPs的基因序列如何？它对细菌耐药性有无影响？研究得出，它的基因序列结构的变化可以导致细菌耐药性。而后引出的问题是：怎样能从基因水平上来控制细菌耐药性的问题，这些研究最终导致青霉素结合蛋白成为生物学研究的热点。

3 青霉素发现及应用过程中提出问题所运用的思维方式

PCN的研究过程采用了哪些思维方式呢？最突出的是在前人研究的基础上，运用求异的思维方式，问一个不同的问题。问题的与众不同，就会导致与众不同的实验。其次是运用置换的思维方式，将研究内容置换一下。例如当发现青霉素能够抗菌后，将研究杀灭细菌的现象置换成灭菌的作用机制；当发现灭菌主要是干扰细菌细胞壁合成以后，又对细胞壁的合成机理进行研究；当发现细胞膜上与青霉素结合的靶蛋白是PBPs，又对PBPs的基因序列进行研究；研究发现PBPs的基因序列的改变与细菌耐药性有关。总而言之，求异思维和置换思维可以说是渗透着青霉素研究及应用的全部过程。这也说明求异和置换这两种思维方式是科研人员的基本思维方式。

4 如何根据文献提出新颖的问题

由青霉素发现及应用的思维方式可以看出：在前人的研究基础上，采用求异思维和置换思维提出一个新颖的科研问题、设计实验是科学研究的基本要求。无数科学家的的研究实践证明：探究源于疑问，科研发仞于选题。如何在研究生的学习、科研过程中，给他们一些建议，促使他们能够在前人研究的基础上选择一个新颖的问题呢？

在教学过程中，运用这个成功的科研例子，把青霉素的研究及应用过程中科学家们如何提出问题，且把他们所采用的思维方式讲述出来，可以让研究生明白：科学研究首先采用求异的思维方式，提出新问题；只要具有了新颖的题目，就可另辟蹊径，独树一帜，避免重复研究。然后，采用置换的思维方法设计实验，解决这个问题。例如置换实验环境，观察这种现象是否在其他温度下也如此？置换部分基因序列，观察结果如何？只要抓住问题关键，深入思考，就能不断提出各种问题，异于前人，先于他人。最后，脚踏实地，循序渐进，解决问题。

在指导研究生选题时，运用将科研成果的研究过程和思维方式相结合的教学方式，效果令人满意。例如，赵璐璐等[5]在阅读有关甲状腺结节消融的文献时，发现颌下腺占位的消融鲜有人报道，于是尝试将颌下腺和甲状腺结节共同消融的治疗方式，取得了满意的疗效，并将成果发表在第二军医大学学报上。刘灿等[6]同样在阅读甲状腺结节消融的文献时，发现甲状腺结节消融报道的较多，他将消融目标置换为甲状旁腺腺瘤，消融后随访患者预后，反映良好，并将相关研究结果发表在第二军医大学学报上。另外，笔者等[7]在研究生期间，由导师指导，阅读有关利用弹性超声评价人体各器官质地软硬程度的文献时，将评价目标置换为离体的正常猪肝及消融后的猪肝，发现了许多新鲜的问题，获取了第一手数据资料，并将研究结果发表在中华超声影像学杂志上。

总之，采用这种教学方法可以指导研究生在阅读文献时，提出新颖的科研问题，并设计实验来回答问题，从而使他们顺利地完成学位论文，走进科研的大门。

[1]Fleming A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillin，with Special Reference to Their Use in the Siolation of B Influenza [J]．Br J Exp Pathol，1926, 10(3)：226．

[2]Florey H W．Antibiotics [M]．London Oxford University press, 1949：230．

[3]Deka R K, Machius M, et al. Crystal structure of the 472-kDa lipoprotein of Treponema pallidum reveals a novel penicillin 2 binding protein [J].BiolChem, 2002, 277(44): 41857-41864.

[4]Tomasz A．“Intelligence coup” for drug designers：crystal structure of Staphylococcus aureus beta-lactam resistance protein PBP2A [J]. Lancet，2003，361(9360)：795.

[5]赵璐璐，章建全. 甲状腺与下颌下腺结节同期微波消融治疗的初步尝试 [J]．第二军医大学学报，2013，34(9)：96-98．

[6]刘 灿，章建全. 超声引导下经皮射频消融治疗甲状旁腺腺瘤的初步临床应用 [J]．第二军医大学学报，2013，34(4)：371-374．

[7]章建全，刁宗平. 离体猪肝微波消融灶的弹性变化及其病理意义[J]. 中华超声影像学杂志，2011，20(1)：76-79．

(责任编辑：陈新东)

2014-07-08

刁宗平(1984-)，女，硕士，专业方向：超声诊断与介入治疗。

章建全

G644

：A

：1006-2769(2014)06-1048-03