Nrf2/Keap1/ARE信号通路与眼科疾病

赵玉霞 姚进

【文献综述】

Nrf2/Keap1/ARE信号通路与眼科疾病

赵玉霞 姚进

Accepted date：Apr 18，2014

From theDepartmentofOphthalmology，theAffiliatedEyeHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，JiangsuProvince，China

Responsible author：YAO Jin，E-mail：dryaojin@vip.sina.com

氧化应激；核因子-E2相关因子2；Nrf2/Keap1/ARE信号通路

氧化应激与多种眼科疾病的病理过程相关。近年的实验研究发现抗氧化应激药物对多种眼球细胞具有良好的保护作用。转录因子核因子-E2相关因子2是细胞抗氧化反应的中枢调节者，在细胞的防御保护中发挥重要作用。本文就核因子-E2相关因子2信号通路与眼科疾病的关系进行综述。

[眼科新进展，2014，34(11)：1097-1100]

目前认为，多种疾病的发生、发展与氧化应激相关。在应激状态下，活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)大量生成，引起细胞内脂质、蛋白质和

DNA的损伤，进而导致细胞死亡和组织损伤[1]，同时ROS也参与炎症、纤维化等其他病理过程[2]。目前研究证实氧化应激在风湿病、糖尿病、心血管疾病、癌症及其他多种慢性疾病的发生发展以及老化过程中扮演了举足轻重的角色，另外有研究发现眼科多种疾病也与氧化应激相关，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)[3]、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)[4]、葡萄膜炎[5]等。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)是调节细胞内众多抗氧化物表达的关键因子，具有维持细胞氧化-抗氧化平衡、抑制凋亡、抗炎等多种生物活性。研究已证实Nrf2对肝脏、肾脏和心脏细胞具有保护作用，同时已用于癌症的临床治疗。Nrf2/Keap1/ARE是公认的抗氧化应激的重要通路，也是目前眼科研究的热点之一。

1 Nrf2/Keap1/ARE信号通路概述

1.1 Nrf2/Keap1/ARE信号通路结构基础 转录因子Nrf2 属于CNC-bZIP(cap n’collar subfamily of basic leucine zipper)，即 CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族，是CNC转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子[6]，Nrf2普遍表达于人体各种组织细胞中[7]。Nrf2包含6个不同的功能区，分别命名为Neh1～6。Neh1为含有C-末端bZIP结构域，与Nrf2识别、结合抗氧化反应元件ARE相关[8]；Neh2通过与Keap1的Kelch区结合可以抑制Nrf2的激活，使其处于失活状态[9]；Neh3是Nrf2的转录激活区域，与CHD6重组蛋白特异性结合后可上调Nrf2靶基因的表达[10]；Neh4和Neh5是激活区，两者同时结合到激活辅助因子CBP从而促进Nrf2下游基因转录的启动[11]；Neh6为氧化还原反应的非敏感区域，其对氧化应激状态下的Nrf2具有降解作用[12]，其确切功能尚未阐明。

Keapl是Kelch家族多区域阻遏蛋白(Nrf2的抑制蛋白)，由NTR、BTB/POZ、IVR、DGR和CTR 5个结构域组成。正常情况下Keapl通过DGR区域与Nrf2相结合，锚定在胞浆内肌动蛋白细胞骨架上[13-14]，使Nrf2不能跨过核膜进入细胞核内，从而抑制Nrf2的活性。NTR、CTR分别为Keap1的两个氨基末端，BTB、IVR、DGR为主要功能区域。BTB是一个蛋白质-蛋白质相互作用结构域，通常和其他Keap1的BTB区形成二聚体后与Nrf2结合。IVR是链接BTB与DGR的区域，该区域富含半胱氨酸，因其可能是对亲电子化合物或氧化剂起反应的感应蛋白，成为整个蛋白的功能调节区，同时IVR区参与泛素连接酶的形成，在无氧化应激状态下参与对Nrf2的泛素化将其降解，所以与Nrf2稳定性有关[15]。

抗氧化反应元件ARE是机体内重要的保护性顺式应答元件，是位于编码解毒酶和保护蛋白基因上游的启动子区域内的一段序列[16]。ARE有一核心序列，即5’-TGACnnnGC-3’(n为任意核苷酸)，这一DNA启动结合区域是诱导解毒酶和保护蛋白基因所必需的[17]，ARE激活后可诱导NADH苯醌氧化还原酶、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1)、谷胱甘肽硫转移酶等大量保护性基因的表达[18]。

1.2 Nrf2/Keap1/ARE信号通路激活机制 目前认为，Nrf2介导的细胞防御反应的开闭主要由Keap1负性调节。在正常生理状态下，Nrf2主要存在于细胞质中，通过与抑制蛋白Keap1结合而处于失活状态，由于后者与胞浆肌动蛋白结合而被锚定在胞浆内[13]，同时Keap1作为泛素化连接酶促进Nrf2泛素化及在蛋白酶作用下降解从而维持Nrf2基础水平[19]；当受到亲电子物质或氧化剂作用时，Keap1上半胱氨酸残基被修饰，引起Keap1构象改变，这种构象改变会破坏Nrf2与Keap1上DGR区的结合力，导致Nrf2与Keap1解耦联，从而使其从细胞质中释放出来[13]。而Nrf2还存在着另一种主要的激活方式——Nrf2的磷酸化，促分裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C、胰腺内质网激酶和磷脂酰肌醇3激酶参与其活化，在Nrf2水平的转录后调节机制中发挥重要作用[18]。Nrf2被激活后，发生核内转位，通过bZIP结构与小Maf蛋白结合形成二聚体活化ARE，从而启动下游II相代谢酶和抗氧化蛋白基因的转录[20]。Nrf2与ARE结合后激活产生的基因能调节包括谷氨酰半胱氨酸合成酶、GSHS转移酶、NADP(H)醌氧化还原酶1[NADP(H) quinone oxidoreductase 1，NQO1]以及HO-1等在内的多种蛋白酶的表达[21]。氧化-还原平衡恢复后，Nrf2与ARE序列解离，输出到胞浆，通过Cullin3依赖的E3泛素连接酶机制进行泛素化后降解，关闭Nrf2通路，重新维持低水平的Nrf2[22]。

1.3 Nrf2信号通路激动剂 许多天然以及化学合成物可以在多种系统中激活Nrf2。特别是植物源性的强Nrf2诱导剂，如莱菔硫烷(十字花科蔬菜)、姜黄素(香料)、表儿茶素酸酯(绿茶)、白藜芦醇(葡萄)、咖啡酸苯乙酯(松树)、咖啡醇和咖啡白(咖啡)、番茄红素(番茄)等，由于其获取容易、作用效果肯定近年来受到广泛关注[13]。而Nrf2的诱导剂根据其化学结构可被分为10类，其中奥替普拉、BG-12、CDDO-Im、CDDO-Me、Protandim为常用的Nrf2活化剂。这些化合物中有些甚至已经进展到人类临床试验，有希望成为如多发性硬化症、肌肉萎缩症、皮肤癌和慢性肾脏疾病等疾病的有效治疗方法[23]。近年来大量研究证明Nrf2诱导剂对眼球多种细胞损伤有保护作用，因此Nrf2通路激动剂激活Nrf2通路，有可能成为眼科多种疾病预防与治疗的新策略。

2 Nrf与眼科疾病

2.1 AMD AMD是引起老年人视力损伤的主要原因之一。2013年WHO全球范围性的调查结果显示AMD是第3大致盲性眼病，并且其发病率在逐年增加。AMD的发病是多种因素长期作用的结果，其中氧化应激对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞的损害作用是导致AMD发生发展的主要病理机制[24]。RPE细胞的损伤归因于细胞内抗氧化防御系统的衰弱或ROS水平的增加。众多研究证明，转录因子Nrf2及其下游信号分子的激活能保护氧化应激造成的RPE细胞的损伤。

Zhao等[25]研究发现，Nrf2基因敲除小鼠的视网膜表现出与人类AMD相似的病理改变，如氧化损伤、过度的自噬和炎症反应等，说明Nrf2信号通路的缺失将增加视网膜年龄相关性疾病的易感性。有研究证明[26]，正常状态下与幼龄鼠相比，大龄鼠RPE细胞表达更高水平的Nrf2目的基因NQO1、GCLM和HO1；在体外实验中，利用碘酸钠刺激引起RPE细胞氧化应激损伤状态下，大龄鼠RPE细胞内保护性Nrf2信号通路活性下调，并且超氧阴离子和丙二醛(氧化应激标志物)水平在大龄鼠RPE细胞内表达水平高于幼龄鼠。上述结果提示氧化应激基础水平随着年龄增长而增加，而RPE细胞内抗氧化应激系统的作用不足以维持ROS的平衡，从而导致氧化应激性损伤。而当敲除Nrf2的负性调控因子keap1却能使大龄鼠RPE细胞Nrf2信号通路活性被部分恢复，同时目的基因NQO-1表达增加[26]。这一结果表明，细胞中Nrf2的激活可有效提高RPE细胞抗氧化损伤能力。Chen等[27]总结出在体外实验中应用不同的Nrf2激动剂均能保护RPE细胞免受氧化应激损伤。

综上所述，Nrf2介导的信号通路能保护年龄相关性的视网膜损伤如AMD，并有可能作为治疗AMD的靶点，同时，RPE细胞中Nrf2的表达对AMD进展有无影响也值得进一步研究。

2.2 DR DR是目前发达国家成人致盲的常见原因，其导致视力障碍和丧失的机制尚未完全阐明，因而引起人们越来越多的关注。目前多数研究证明，在糖尿病的微环境中，高血糖、多元醇-肌醇代谢异常、蛋白质非酶促糖基化、氧自由基形成及血管增生因子等多种因素协同作用导致视网膜几乎所有类型细胞的功能和结构发生变化，从而引起视网膜微血管与神经细胞的病变[28]。尤其，高血糖能够诱导细胞内ROS生成增加，而ROS又能启动血糖异常代谢途径，而各种代谢产物又不断将氧化应激放大，导致更多的自由基生成，激发了更大的氧化应激，最终引起视网膜毛细血管内皮细胞及周细胞凋亡，血-视网膜屏障破坏以及视网膜神经节细胞凋亡[29]。

Fan等[28]研究发现，通过诱导SOD、Bcl2活化增加，减少缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子以及P53的表达，从而降低了糖尿病小鼠视网膜神经节细胞的凋亡。Xu等[4]用免疫组织化学染色方法证明Nrf2在人视网膜多种细胞中表达。同时经研究发现，在Nrf2-/-糖尿病小鼠中过氧化物表达明显高于Nrf2+/+糖尿病小鼠。Nrf2-/-糖尿病小鼠视网膜中抗氧化蛋白GSH水平明显低于野生型糖尿病小鼠，而引起DR的重要炎症因子肿瘤坏死因子-α却明显高于野生型小鼠。Nrf2信号通路在延缓DR发生发展中起到了重要作用。

2.3 葡萄膜炎 葡萄膜炎是一组累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的炎症，也称为眼内炎症[30]，是一种种类繁多、病因复杂的致盲性眼病，并且能够引起并发性白内障、继发性青光眼、玻璃体混浊、增生性玻璃体视网膜病变、牵拉性视网膜脱离和黄斑囊样水肿等多种并发症[31]。葡萄膜炎主要分为感染性和非感染性两大类。进来研究发现自由基和氧化应激在葡萄膜炎的发病中起着重要作用，这是由于氧化应激产生的ROS是引起葡萄膜炎相关细胞因子和趋化因子的必须介质[32]。

目前多应用腹腔注射内毒素建立实验性自身免疫性葡萄膜炎模型。Nagai等[5]研究表明，腹腔注射LPS增加Nrf2+/+和 Nrf2-/-小鼠视网膜和虹膜睫状体内ROS水平，而Nrf2-/-小鼠视网膜和虹膜睫状体内促炎症因子细胞间黏附分子-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、iNOS和MCP-1的 mRNAs水平远高于Nrf2+/+小鼠。同时，Nrf2-/-小鼠视网膜血管内皮细胞处黏附的白细胞数量也明显大于Nrf2+/+小鼠。应用Nrf2激动剂作用于内毒素处理的Nrf2+/+小鼠能增加视网膜抗氧化因子HO-1等的表达，减少炎症介质表达及白细胞黏附，然而Nrf2激动剂对Nrf2-/-小鼠无上述作用。说明Nrf2信号通路在葡萄膜炎的发生发展过程中起重要的保护作用。

2.4 视神经损伤 青光眼晚期患者由于视网膜神经节细胞的死亡导致视力丧失。众多实验已证明Nrf2介导的信号通路能保护氧化应激所致的神经退行性病变。体内及体外研究均发现，长效栀子素衍生物能通过激活Nrf2信号通路减少氧化应激损伤所致的视网膜神经节细胞的死亡[33]，抗氧化剂R-α硫辛酸通过激活Nrf2信号通路上调下游因子HO-1的表达，从而保护氧化应激导致的视网膜神经节细胞的损伤[34]。Himori等[35]在体内实验中证明Nrf2激动剂CDDO-Im能减少野生型小鼠视神经夹伤后视网膜神经节细胞的存活率。神经夹伤后7 d，未经任何处理的Nrf2-/-小鼠视网膜神经节细胞数量明显少于野生型小鼠。结果说明Nrf2介导的信号通路能减轻氧化应激导致的视网膜神经节细胞的死亡。由此可推论，上调Nrf2信号通路能减轻视网膜神经节细胞的损伤。

2.5 早产儿视网膜病变 早产儿视网膜病变是致盲性新生儿眼病。早产儿视网膜病变与早产、低出生体质量以及吸高浓度氧密切相关。Uno等[36]在早产儿视网膜病变模型小鼠实验中，出生后第9天的Nrf2-/-小鼠视网膜新生血管生成范围明显大于Nrf2+/+小鼠和野生型小鼠。说明Nrf2介导的抗氧化反应能减轻高氧对血管内皮细胞的损害。

3 小结

Nrf2在眼科疾病中的研究已成为当前热点。众多研究表明，Nrf2在多种眼科疾病中具有保护作用，其保护作用涉及多个环节，但其在多种眼科疾病的发生发展机制中究竟扮演了什么角色，还有待于进一步研究。目前的动物实验已显示多种Nrt2激动剂对多种眼细胞具有保护作用，因此Nrf2/Keap1/ARE通路可作为治疗眼科疾病的一个新的靶点，预期对临床眼科疾病的治疗发挥重要作用。

1 Bartz RR，Piantadosi ZA.Clinical review：Oxygen as a signaling molecule[J].CritCare，2010，14(5)：234-236.

2 Ruiz S，Pergola PE，Zager RA，Vaziri ND.Targeting the transcription factor Nrf2 to ameliorate oxidative stress and inflammation in chronic kidney disease[J].KidneyInt，2013，83(6)：1029-1041.

3 Sachdeva MM，Cano M，Handa JT.Nrf2 signaling is impaired in the aging RPE given an oxidative insult[J].ExpEyeRes，2014，119：111-114.

4 Xu Z，Wei Y，Gong J，Cho H，Park JK，Sung ER，etal.NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice[J].Diabetologia，2014，57(1)：204-213.

5 Nagai N，Thimmulappa PK，Cano M，Fujihara M，Izumi-Naqai K，Kong X，etal.Nrf2 is a critical modulator of the innate immune response in a model of uveitis[J].FreeRadicBiolMed，2009，47(3)：300-306.

6 Toyokuni S，Akatsuka S.Pathological investigation of oxidative stress in the post-genomic era[J].PatholInt，2007，57(8)：461-473.

7 Moi P，Chan K，Asunis I，Cao A，Kan YW.Isolation of NF-E2-related factor 2(Nrf2)，a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region[J].ProcNatlAcadSciUSA，1994，91(21)：9926-9930.

8 Plafker KS，Nguyen L，Barneche M，Mirza S，Crawford D，Plafker SM.The ubiquitin-conjugating enzyme ubcM2 can regulate the stability and activity of the antioxidant transcription factor Nrf2[J].JBiolChem，2010，285(30)：23064-23074.

9 Itoh K，Wakabayashi N，Katoh Y，Ishii T，O’Connor T，Yamamoto M.Keap 1 regulates both cytoplasmic-nuclear shuttling and degradation of Nrf2 in response to electrophiles[J].GenesCells，2003，8(4)：379-391.

10Nioi P，Nguyen T，Sherratt PJ，Pickett CB.The carboxy-terminal Neh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation[J].MolCellBiol，2005，25(24)：10895-15906.

11Katoh Y，Itoh K，Yoshida E，Miyagishi M，Fukamizu A，Yamamoto M.Two domains of Nrf2 cooperatively bind CBP，a CREB binding protein，and synergistic ally activate transcription[J].GenesCells，2001，6(10)：857-868.

12McMahon M，Thomas N，Itoh K，Yamamoto M，Hayes JD.Redox-regulatd turnover of Nrf2 is determined by at least two separate protein domains，the redox-sensitive Neh2 degron and the redox-insensitive Neh6 degron[J].JBiolChem，2004，279(30)：31556-31567.

13Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway[J].DrugMetabRev，2006，38(4)：769-789.

14Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，Kim SG，Yamamoto M.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes[J].ProcNatlAcadSciUSA，2004，101(7)：2046-2051.

15Ogura T，Tong KI，Mio K，Maruyama Y，Kurokawa H，Sato C，etal.Keap1 is a forked-stem dimer structure with two large spheres enclosing the intervening，double glycine repeat，and C-terminal domains[J].ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(7)：2842-2847.

16Magesh S，Chen Y，Hu L.Small molecule modulators of keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents[J].MedResRev，2012，32(4)：687-726.

17Rushmore TH，Morton MR，Pickett CB.The antioxidant responsive element.Activation by oxidative stress and identification of the DNA consensus sequence required for functional activity[J].JBiolChem，1991，266(18)：11632-11639.

18Surh YJ.Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals[J].NatRevCancer，2003，3(10)：768-780.

19Tong KI，Kobayashi A，Katsuoka F，Yamamoto M.Two-site substrate recognition model for the Keap1-Nrf2 system：a hinge and latch mechanism[J].BiolChem，2006，387(10-11)：1311-1320.

20Wakabayashi N，Dinkova-Kostova AT，Holtzclaw WD，Kang MI，Kobayashi A，Yamamoto M，etal.Protection against electrophile and oxidant stress by induction of the phase 2 response：fate of cysteines of the Keap1 sensor modified by inducers[J].ProcNatlSciUSA，2004，101(7)：2040-2045.

21Osburn WO，Kensler TW.Nrf2 signaling：an adaptive response pathway for protection against environmental toxic insults[J].MutatRes，2008，659(1-2)：31-39.

22林晓萍，李雯，沈华浩.抗氧化应激转录因子Nrf2的研究进展[J].中国病理生理杂志，2011，27(6)：1234-1239.

23Bataille AM，Manautou JE.Nrf2：A potential target for new therapeutics in liver disease[J].ClinPharmacolTher，2012，92(3)：340-348.

24Plafker SM.Oxidative stress and the ubiquitin proteolytic system in age-related macular degeneration[J].AdvExpMedBiol，2010，664(3)：447-456.

25Zhao Z，Chen Y，Wang J，Sternberg P，Freeman ML，Grossniklaus HE，etal.Age-related retinopathy in NRF2-deficient mice[J].PlosONE，2011，6(4)：e19456.

26Sachdeva MM，Cano M，Handa JT.Nrf2 signaling is impaired in the aging RPE given an oxidative insult[J].ExpEyeRes，2014，119(1)：111-114.

27Chen Y，Zhao Z，Sternberg P，Cai JY.NRF2 and age-dependent RPE degeneration[J].AdvOphthalmol， 2012，96(3)：427-450.

28Fan J，Xu G，Jiang T，Qin Y.Pharmacologic induction of heme oxygenase-1 plays a protective role in diabetic retinopathy in rats[J].InvestOphthalmolVisSci，2012，53(10)：6541-6556.

29Maher P，Hanneken A.Flavonoids protect retinal ganglion cells from oxidative stress-induced death[J].InvestOphthalmolVisSci，2005，46(12)：4796-4803.

30杨培增.临床葡萄膜炎[M].北京：人民卫生出版社，2004：43-44.

31Zerturk Y，Bardak Y，Durmus M.Vitreoretinal surgery in Behcrt’s disease with severe ocular complications[J].ActaOphthalmolScand，2001，79(2)：192-196.

32Yadav UC，Kalariya NM，Ramana KV.Emerging role of antioxidants in the protection of uveitis complications[J].CurrMedChem，2011，18(6)：931-942.

33Koriyama Y，Chiba K，Yamazaki M，Suzuki H，Muramoto K，Kato S.Long-acting genipin derivative protects retinal ganglion cells from oxidative stress modelsinvitroandinvivothrough the Nrf2/antioxidant response element signaling pathway[J].JNeurochem，2010，115(1)：79-91.

34Koriyama Y，Nakayama Y，Matsugo S，Kato S.Protective effect of lipoic acid against oxidative stress is mediated by Keap1/Nrf2-dependent heme oxygenase-1 induction in the RGC-5 cellline[J].BrainRes，2013，1499(1)：145-157.

35Himori N，Yamamoto K，Maruyama K，Ryu M，Taguchi K，Yamamoto M，etal.Critical role of Nrf2 in oxidative stress-induced retinal ganglion cell death[J].JNeurochem，2013，127(5)：669-680.

36Uno K，Prow TW，Bhutto IA，Yerrapureddy A，McLeod DS，Yamamoto M，etal.Role of Nrf2 in retinal vascular development and the vaso-obliterative phase of oxygen-induced retinopathy[J].ExpEyeRes，2010，90(4)：493-500.

date：Mar 13，2014

Nrf2/Keap1/ARE pathway and eye diseases

ZHAO Yu-Xia，YAO Jin

oxidative stress；nuclear factor E2 related factor 2;Nrf2/keap1/ARE pathway

Oxidative stress is involved in pathologies of numerous ophthalmic diseases.Recently，plenty of experimental researches have demonstrated that drugs which resistance to oxidative stress provide a protective effects on many ocular cells.Transcription factor 2 of NF-E2(Nrf2)，which plays an important role in cell defending，is the major moderator of anti-oxidative.This article reviews the relationship between signaling pathway Nrf2 and ophthalmic diseases.

赵玉霞，姚进.Nrf2/Keap1/ARE信号通路与眼科疾病[J].眼科新进展，2014，34(11)：1097-1100.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0305

赵玉霞，女，1985年9月出生，河北人，在读硕士研究生。联系电话：18262636992；E-mail：zhaoyu xia618@163.com

About ZHAO Yu-Xia：Female，born in September，1985.Postgraduate student.Tel：18262636992；E-mail：zhaoyuxia618@163.com

2014-03-13

210029 江苏省南京市，南京医科大学附属眼科医院

姚进，E-mail：dryaojin@vip.sina.com

修回日期：2014-04-18

本文编辑：盛丽娜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1097-1100]