复方丹参滴丸对视网膜缺血再灌注损伤模型大鼠的疗效观察

陆秉文 吴星伟

【实验研究】

复方丹参滴丸对视网膜缺血再灌注损伤模型大鼠的疗效观察

陆秉文 吴星伟

Accepted date：Jul 15，2014

From theDepartmentofOphthalmology，ShanghaiFirstPeople’sHospital，Shanghai200080，China

Responsible author：WU Xing-Wei，E-mail：wxweye@sina.com

复方丹参滴丸；视网膜缺血再灌注损伤；细胞凋亡；视网膜电流图；大鼠

目的 探究复方丹参滴丸对大鼠视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)的影响。方法 将42只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组(6只)、模型组(18只)和治疗组(18只)。模型组和治疗组采用前房灌注加压建立大鼠RIRI模型，治疗组RIRI后立即给予复方丹参滴丸(450 mg·kg-1·d-1)灌胃，连续7 d，模型组和正常对照组灌胃等量生理盐水。观察RIRI后24 h、7 d视网膜电流图的改变，并取视网膜行组织病理学观察。测量RIRI后24 h、7 d视网膜各层厚度，同时计数视网膜神经节细胞数。结果 RIRI后24 h及7 d，模型组视网膜电流图的b波振幅分别为(92.33±24.36)μV及(101.28±21.97)μV，较正常对照组大鼠测量到的(215.40±35.91)μV显著降低，而治疗组的b波振幅分别为(137.07±22.71)μV及(166.24±16.72)μV，较模型组显著好转(均为P<0.05)；各组a波与b波的变化趋势相同。大鼠RIRI后24 h，模型组全层视网膜高度水肿，可见大量空泡变性，RIRI后7 d，视网膜厚度明显变薄，而治疗组大鼠视网膜的组织病理学损害较模型组均明显减轻。结论 复方丹参滴丸可从形态学及功能学上减轻大鼠RIRI损伤。

[眼科新进展，2014，34(11)：1030-1034]

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)是目前眼科临床常见的病理生理损伤，通常发生在视网膜血管阻塞等缺血性眼底病中，即各种原因造成的不同程度的视网膜缺血，在血供恢复后，视网膜反而受到更为严重的不可逆性损伤，造成视功能的下降[1]。RIRI的机制复杂，主要涉及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[2-3]、细胞内钙超载[4]、兴奋性氨基酸[5]、炎症反应[6]及细胞凋亡[7]等。因此，对RIRI防治的探究已成为当今科研和临床关注的热点。越来越多的研究表明，药物对RIRI具有一定的保护作用。复方丹参滴丸是由丹参、三七中提取有效成分，配以冰片制成的新型纯中成药滴丸剂，具有清除氧自由基、阻滞钙通道、稳定细胞膜等作用，长期以来用于冠心病、心绞痛等心血管疾病的治疗中，具有明显疗效[8]。本实验采用近年来国内外常用的前房灌注加压建立大鼠RIRI模型，通过检测视网膜电流图(electroretinogram，ERG)，并观察视网膜组织病理学改变，拟探究复方丹参滴丸是否能减轻大鼠视网膜缺血再灌注所致的损伤，从而为临床用药提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 健康成年SD大鼠42只，体质量200～350 g，由昭衍(苏州)新药研究中心有限公司提供。动物饲养于普通级环境，用装有垫料的聚碳酸酯盒饲养，自由摄食和饮水。动物房通风良好，室温控制在20～26 ℃，相对湿度控制在40%～70%，光照12 h明暗交替。大鼠随机抽签分为正常对照组(6只)、模型组(18只)和治疗组(18只)。

1.1.2 实验试剂与仪器 复方丹参滴丸(棕色薄膜衣滴丸，每丸27 mg)由天津天士力制药股份有限公司提供，产品批号：110105，溶液配制：将灭菌注射用水加热至36～38 ℃，将定量的复方丹参滴丸溶入加热的注射用水中，充分振荡溶解，配制成45 g·L-1的复方丹参滴丸溶液。Espion单焦、多焦电生理一体机(Diagnosys LLC D2/5)；光学显微镜(日本 OLYMPUS BH-2)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及处理 采用前房灌注加压建立大鼠RIRI模型。模型组和治疗组大鼠均建模，具体方法为：10 g·L-1戊巴比妥钠(7 mL·kg-1体质量)腹腔内注射麻醉大鼠；将大鼠固定于加热板上(俯卧位)，保持实验中温度恒定；每只动物均取一眼(标记眼)进行造模，滴复方托吡卡胺滴眼液及盐酸奥布卡因滴眼液以散大瞳孔并进行角膜表面麻醉；将30 G注射针头自大鼠颞侧角膜缘向前房内刺入，避免伤及角膜、晶状体及虹膜；固定灌注针头，迅速升高预先与针头相连的250 mL生理盐水输液袋，使液平面距离术眼的垂直距离为150 cm。此时大鼠前房眼压为110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。肉眼观察术眼：球结膜苍白，虹膜迅速变白，提示视网膜中央动脉血供已被完全阻断；持续60 min，随后降低生理盐水输液袋高度，拔出灌注针头。肉眼观察术眼：球结膜及虹膜颜色迅速恢复正常，提示视网膜原先被阻断的血供重新恢复，形成再灌注；术毕，迪可罗眼膏涂眼，以保持角膜湿润、预防感染。

确认大鼠RIRI后立即给予相应剂量的药物或溶媒：治疗组按450 mg·kg-1复方丹参滴丸灌胃给药，每天1次，连续7 d；模型组及正常对照组均灌胃等量生理盐水，每天1次，连续7 d。

1.2.2 ERG检测 RIRI后24 h，模型组和治疗组各随机选取9只大鼠、正常对照组随机选取3只大鼠行双眼ERG检测，各组其余大鼠均于RIRI后7 d行双眼ERG检测。将动物转移至暗房过夜，所有步骤均在暗红灯下操作。用10 g·L-1戊巴比妥钠(4 mL·kg-1体质量)腹腔注射麻醉大鼠，滴复方托吡卡胺滴眼液及盐酸奥布卡因滴眼液散瞳并行角膜表面麻醉，使用Espion单焦、多焦电生理一体机进行ERG测定。记录电极置于角膜中央，在角膜表面涂适量迪可罗眼膏，参考电极以及接地电极分别置于大鼠的两颊及尾部皮下。刺激器型号D300，记录参数为：刺激光强：0.01 c·d-1、3.00 c·d-1、10.00 c·d-1；循环时间：5 s、15 s、20 s；采样频率：1000 Hz；通频带：0.312～300.000 Hz。记录ERG的 a波及b波振幅：a波的波幅值为基线到a波波谷这段距离代表的振幅；b波的波幅值为a波波谷到b波波峰这段距离代表的振幅。每个波幅值的单位均为微伏(μV)。

1.2.3 大鼠眼球病理切片的制作及观察 10 g·L-1戊巴比妥钠过量腹腔内注射处死ERG检测后的大鼠(RIRI后24 h及7 d；模型组与治疗组每组9只，正常对照组3只)，用5-0线在大鼠角膜上方12点处的角巩膜缘缝线标记，完整摘出术眼；制作石蜡包埋切片，行HE染色、光镜观察及TUNEL检测。切片：经缝线与视神经矢状面做5 μm连续石蜡切片，每个标本切片2张，切片范围为距视盘500 μm处两侧。视网膜测厚：测量视网膜全层厚度(retinal total length，RTL)、神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)厚度、内核层(inner nuclear layer，INL)厚度以及内丛状层(inner plexiform layer，IPL)厚度，每张切片各测3次取其平均值。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)计数：计数切片每200 μm长度内RGC的个数，每张切片各测3次，取其平均值。

2 结果

2.1 ERG检测结果 大鼠RIRI后24 h及7 d，各组大鼠均可记录到典型的ERG标准混合反应图形(图1-图2)，记录各组大鼠双眼ERG的a波及b波振幅，具体见表1。由表1知，大鼠RIRI后不同时间点，模型组ERG的a波及b波振幅均明显降低，与正常对照组相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)；治疗组ERG的a波及b波振幅虽然低于正常对照组，但与模型组相比显著提高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.2 视网膜组织病理学观察及检测结果 光学显微镜下观察各组大鼠视网膜HE染色切片可见，正常对照组大鼠视网膜分层清晰，各层结构无明显异常(图3A)；视网膜GCL的细胞呈单层排列，胞核为圆形或椭圆形；IPL呈疏松网状结构；INL由3～5层细胞核较大的细胞构成；外丛状层(outer plexiform layer，OPL)较薄，其网状结构没有IPL明显；外核层(outer nuclear layer，ONL)由8～10层排列紧密、细胞核较小的细胞构成。大鼠RIRI后24 h，模型组全层视网膜高度水肿，GCL大量空泡变性，IPL及INL水肿明显(图3B)；治疗组视网膜各层轻度水肿，结构较清晰，GCL细胞排列较疏松但完整，可见空泡变性，IPL细胞分散，偶见空泡(图3C)。RIRI后7 d，模型组视网膜结构层次与正常对照组大致相似，细胞排列较整齐，但视网膜厚度变薄，以INL及IPL厚度降低最为明显；治疗组视网膜结构层次亦与正常对照组大致相似，细胞排列整齐，视网膜厚度虽亦有变薄，但与模型组相比程度明显减轻(图4)。大鼠RIRI后24 h及7 d，视网膜各层厚度及RGC计数结果见表2和表3。RIRI后24 h，视网膜全层结构可见明显异常；RIRI后7 d，视网膜厚度明显变薄。

表1 各组大鼠RIRI后不同时间ERG中a波、b波振幅情况

Table 1 Changes of a-wave and b-wave amplitudes at different time after RIRI

±s，U/μV)

Figure 1 ERG at 24 hours after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group.Figure 2 ERG at 7 days after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 图1 大鼠视网膜缺血再灌注损伤后24 h ERG。A：正常对照组；B：模型组；C：治疗组。图2 大鼠视网膜缺血再灌注损伤后7 d ERG。A：正常对照组；B：模型组；C：治疗组

Figure 3 Histopathological examination of retina at 24 hours after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 大鼠RIRI后24 h视网膜形态变化。A：正常对照组；B：模型组；C：治疗组

Figure 4 Histopathological examination of retina at 7 days after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 大鼠RIRI后7 d视网膜形态变化。A：正常对照组；B：模型组；C：治疗组

表2 RIRI后24 h各组大鼠视网膜各层厚度及RGC计数

Note：Compared with the sham group，aP<0.05；Compared with the model group，bP<0.05

表3 RIRI后7 d各组大鼠视网膜各层厚度及RGC计数

Note：Compared with the sham group，aP<0.05；Compared with the model group，bP<0.05

3 讨论

视网膜对缺血缺氧耐受性差，易遭受各种病理因子的损害，产生多种多样的视网膜疾病，而RIRI是指视网膜在恢复血供后，反而出现明显的功能障碍，甚至发生不可逆损伤，即再灌注并未缓解由缺血造成的细胞损伤，反而加剧了细胞死亡[1]。由于RIRI的机制是多方面的，因此，通过建立RIRI模型，研究其发生机制及防治方法在国内外备受关注。

目前RIRI模型的建立通常采用两种方法：血管结扎模型以及升高眼压模型。结扎视网膜中央动静脉以及视神经[9]或同时结扎双侧颈总动脉[10]虽然可以造成视网膜组织的完全缺血，但手术操作复杂、动物死亡率高、干扰因素多，因此近年来已较少应用。

本研究参照Büchi等[11]的方法，通过前房加压灌注升高眼压的方法建立大鼠RIRI模型，使眼压超过体循环收缩压或达到一定的数值，造成整个视网膜的缺血。Büchi等[11]证明：增加眼压引起的视网膜损伤是由于缺血再灌注所致。这种方法较血管结扎法简便，缺血持续时间易于控制，是目前研究视网膜缺血性疾病广泛应用的模型。本研究前房加压灌注过程中均可观察到大鼠球结膜苍白、角膜水肿、视网膜颜色变白、视网膜血管明显变细等缺血改变；而降低生理盐水袋的高度后，大鼠球结膜、角膜、视网膜均恢复正常，提示大鼠RIRI模型成功建立。

ERG是评价视网膜功能的一种有效、客观且无创的检查方法，广泛用于视网膜疾病的临床以及科研中[12-13]。ERG的a波及b波振幅是反映视网膜功能的两个重要指标：a波起源于视网膜外层的神经元，主要反映视网膜光感受器细胞的电活动；b波起源于双极细胞及Müller细胞，反映了视网膜内核层细胞的电活动[14]。即使视网膜缺血组织形态上无明显变化，b波仍能敏感反映出缺血对视网膜造成的损伤，因此是缺血模型实验研究的常用评价指标[15-16]。在本研究中，模型组ERG的a波及b波振幅均明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；复方丹参滴丸治疗组ERG的a波及b波振幅较模型组均有不同程度的恢复，差异亦均有统计学意义(均为P<0.05)，说明复方丹参滴丸干预治疗对RIRI可产生一定的保护作用。

本研究发现，RIRI可致视网膜组织结构出现明显异常。RIRI后24 h的视网膜组织病理学切片HE染色显示：正常对照组视网膜结构清晰、完整，模型组视网膜各层组织细胞明显水肿，而治疗组视网膜水肿程度较模型组明显减轻。RIRI后7 d的视网膜组织切片HE染色显示：模型组与正常对照组相比，虽然细胞形态、排列大致正常，其视网膜厚度明显变薄；治疗组与模型组相比，视网膜厚度变薄程度明显减轻。以上结果提示复方丹参滴丸干预治疗对RIRI所致的视网膜形态损伤可产生一定的保护作用。

复方丹参滴丸是在现代高科技条件下，严格按照中医君、臣、佐、使的药物配伍配比制成的新型纯中药，其中丹参为君药，三七为臣药，冰片为佐使药，长期以来用于冠心病、心绞痛等心血管疾病的治疗中[8]。最新研究表明，复方丹参滴丸在其他组织器官缺血再灌注损伤中有保护作用，可减少缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[17-18]，并可改善缺血再灌注所致的肝脏微循环障碍和肝损伤[19]。从丹参中提取的水溶性成分丹参素具有抗氧化、抗炎、清除自由基等作用[20]；三七中的主要活性成分——三七总皂苷(PNS)，具有抗氧化、抗炎、阻滞钙通道等作用[21]；而冰片则能改善血脑屏障通透性，提高中药成分在组织中的浓度。

本研究从功能学及形态学两方面证明复方丹参滴丸对RIRI具有较好的保护作用，是一种治疗视网膜缺血性疾病的有效药物，其作用的具体机制有待更深入研究。

1 Osborne NN，Casson RJ，Wood JP，Chidlow G，Graham M，Melena J，etal.Retinal ischemia：mechanisms of damage and potential therapeutic strategies[J].ProgRetinEyeRes，2004，23(1)：91-147.

2 Li SY，Fu ZJ，Ma H，Jang WC，So KF，Wong D，etal.Effect of lutein on retinal neurons and oxidative stress in a model of acute retinal ischemia/reperfusion[J].InvestOphthalmolVisSci，2009，50(2)：836-843.

3 贺玲.原花青素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视神经的保护作用[J].新乡医学院学报，2012，29(1)：26-28.

4 Liu H，Cala PM，Anderson SE.Na/H exchange inhibition protects newborn heart from ischemia/reperfusion injury by limiting Na+-dependent Ca2+overload[J].JCardiovascPharmacol，2010，55(3)：227-233.

5 Kwon YH，Rickman DW，Baruah S，Zimmerman MB，Kim CS，Boldt HC，etal.Vitreous and retinal amino acid concentrations in experimental central retinal artery occlusion in the primate[J].Eye(Lond)，2005，19(4)：455-463.

6 Sanchez RN，Chan CK，Garg S，Kwong JM，Wong MJ，Sadun AA，etal.Interleukin-6 in retinal ischemia reperfusion injury in rats[J].InvestOphthalmolVisSci，2003，44(9)：4006-4011.

7 Miyaki K，Matsubara A，Nishiwaki A，Tomida K，Morita H，Yoshida M，etal.Pitavastatin attenuates leukocyte-endothelial interactions induced by ischemia-reperfusion injury in the rat retina[J].CurrEyeRes，2009，34(1)：10-17.

8 刘新秋，杨荷霞，吴妮丽.复方丹参滴丸对冠心病患者血清超敏-C反应蛋白、脂联素和尿酸水平的影响[J].新乡医学院学报，2012，29(4)：286-288.

9 Nonaka A，Kiryu J，Tsujikawa A，Yamashiro K，Miyamoto K，Nishiwaki H，etal.Administration of 17 beta-estradiol attenuates retinal ischemia-reperfusion injury in rats[J].InvestOphthalmolVisSci，2000，41(9)：2689-2696.

11Büchi ER，Suivaizdis I，Fu J.Pressure-induced ischemia in rat：an experimental model for quantitative study[J].Ophthalmologica，1991，202(3)：138-147.

12Block F，Schwarz M.The b-wave of the electroretinogram as an index of retinal ischemia[J].GenPharmacol，1998，30(3)：281-287.

13Noma H，Funatsu H，Mimura T.Association of electroretinographic parameters and inflammatory factors in branch retinal vein occlusion with macular oedema[J].BrJOphthalmol，2012，96(12)：1489-1493.

14Stockton RA，Slaughter MM.B-wave of the electroretinogram.A reflection of on bipolar cell activity[J].JGenPhysiol，1989，93(1)：101-122.

15Grozdanic SD，Sakaguchi DS，Kwon YH，Kardon RH，Sonea IM.Functional characterization of retina and optic nerve after acute ocular ischemia in rats[J].InvestOphthalmolVisSci，2003，44(6)：2597-2605.

16Bennett LD，Brush RS，Chan M，Lydic TA，Reese K，Reid GE，etal.Effect of reduced retinal VLC-PUFA on rod and cone photoreceptors[J].InvestOphthalmolVisSci，2014，55(5)：3150-3157.

17赵明中，汪家瑞，魏嘉平，高承梅，张宇洋.复方丹参滴丸对大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响[J].中国临床药理学杂志，1999，15(4)：288-291.

18王学莉，顾振纶，王道生，招明高.复方丹参滴丸干预大鼠心肌再灌注损伤的机制研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2006，4(9)：789-790.

19Horie Y，Han JY，Mori S，Konishi M，Kajihara M，Kaneko T，etal.Herbal cardiotonic pills prevent gut ischemia/reperfusion-induced hepatic microvascular dysfunction in rats fed ethanol chronically[J].WorldJGastroenterol，2005，11(4)：511-515.

20袁恒杰.丹参素药理作用研究新进展[J].中国医院药学杂志，2006，26(5)：604-606.

21杨志刚，陈阿琴，俞颂东，孙红祥.三七皂苷药理作用研究进展[J].中国兽药杂志，2005，39(1)：33-37.

date：Apr 9，2014

Protective effects of compound danshen dripping pills on retinal ischemia-reperfusion injury in Rats

LU Bing-Wen，WU Xing-Wei

compound danshen dripping pills；retinal ischemia-reperfusion injury；cell apoptosis；electroretinogram；rat

Objective To study the effects of compound danshen dripping pills on retinal ischemia-reperfusion injury(RIRI) in rats.Methods Forty-two adult healthy SD rats were randomly divided into 3 groups：Sham group(6 rats)，model group(18 rats) and treatment group(450 mg·kg-1·d-1)(18 rats).The model of RIRI was established by increasing the intraocular pressure via cannulation into the anterior chamber.Electroretinogram(ERG) was recorded at 24 hours and 7 days after RIRI，respectively，then pathological changes of the retina were observed with light microscope.Thicknesses of the retinal layers and RGC cell counts were calculated at 24 hours and 7 days respectively after RIRI.Results At 24 hours and 7 days after RIRI，the b-wave amplitudes of the model group were (92.33±24.36)μV and (101.28±21.97)μV，respectively，which were much lower than the sham group (215.40±35.91)μV.While the b-wave amplitudes of the treatment group were (137.07±22.71)μV and (166.24±16.72)μV，respectively，which were higher than the model group(allP<0.05).In the model group，all layers of the retinas were highly edema with enormous vacuolar degeneration at 24 hours after RIRI，and the thicknesses of retinas were greatly reduced at 7 days after RIRI，as shown in the HE analysis.These insults were reversed to some extent in the compound danshen dripping pills treatment group.Conclusion Compound danshen dripping pills may have a protective effect on the retinal morphology as well as the retinal function after RIRI.

陆秉文，吴星伟.复方丹参滴丸对视网膜缺血再灌注损伤模型大鼠的疗效观察[J].眼科新进展， 2014，34(11)：1030-1034.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0285

陆秉文，女，1988年1月出生，上海人，在读博士研究生。联系电话：18916121579；E-mail：704487389@qq.com

About LU Bing-Wen：Female，born in January，1988.Doctoral candidate.Tel：18916121579；E-mail：704487389@qq.com

2014-04-09

200080 上海市，上海市第一人民医院眼科

吴星伟，E-mail：wxweye@sina.com

修回日期：2014-07-15

本文编辑：盛丽娜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1030-1034]