软骨调节素Ⅰ的研究进展

冉祥根(综述)，刘 成(审校)

(1.内蒙古医科大学，呼和浩特 010110； 2.解放军第二五三医院骨科，呼和浩特 010051)

软骨细胞在胚胎期软骨内骨形成和骨轴向生长过程中起关键作用，此过程中依靠许多软骨细胞外基质中的各种生长和分化因子，以调节软骨细胞的新陈代谢活动，如纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子(endothelial growth factor，VEGF)及骨形态发生蛋白，这些因子广泛存在于软骨之外的其他组织。软骨与其他间叶组织起源的组织不同，软骨细胞外基质内包含VEGF这类强效促血管生成因子而仍无血管生成，表明软骨内有血管生成抑制物存在。软骨调节素Ⅰ(chondromodulin-Ⅰ,ChM-Ⅰ)的作用尤为显著，在软骨、角膜、心脏瓣膜等无血管组织中表达。骨关节炎、心脏瓣膜病以及骨或软骨肿瘤等疾病中，都可发现ChM-Ⅰ的表达发生变化。

1 ChM-Ⅰ的发现

1987年Suzuki等[1]研究发现，胎牛骨骺提取物可协同刺激含有FGF-2的培养液中兔生长板软骨细胞的DNA合成。1991年Hiraki等[2]从胎牛骺软骨胍乙酸提取物中提取该物质，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其为相对分子质量为25×103的糖蛋白，将其命名为ChM-Ⅰ。并在同时进行的另一项实验中发现，从胎牛骺软骨中提取出具有血管内皮细胞生长抑制作用的活性蛋白，证实与ChM-Ⅰ为同一蛋白[3]。

2 ChM-Ⅰ的基因结构及表达调控

Hiraki等[2]通过对牛ChM-ⅠcDNA的核苷酸序列分析表明，成熟的ChM-Ⅰ由121个氨基酸组成并含有3个可能糖基化位点，由含有335个氨基酸的前体蛋白C端编码，没有典型的N端前导序列将ChM-Ⅰ导入内质网。对ChM-Ⅰ前体氨基酸序列的亲水片段推断，其前体蛋白在近N端含有27个氨基酸组成的单独极为疏水性区域，推测为跨膜区。由于潜在的加工信号先于ChM-Ⅰ序列成熟前出现，在非洲绿猴肾细胞或中国仓鼠肾细胞中表达的ChM-Ⅰ前体cDNA引起条件培养液中剪切自前体蛋白的ChM-Ⅰ成熟糖基化模式的复原[3-4]。最终在激素加工信号作用下切割ChM-Ⅰ后以相对分子质量为25×103的糖蛋白形式经细胞分泌。分泌后的成熟ChM-Ⅰ蛋白作为细胞外基质成分在软骨的细胞外基质累积。加工信号位点基因序列在哺乳动物和鸡的ChM-Ⅰ前体模式中高度保守[5]。

3 ChM-Ⅰ在软骨组织中的表达及生理作用

Shukunami等[6]认为，在胚胎发育期的早期软骨形成阶段ChM-Ⅰ与Ⅱ型胶原酶表达关系密切。在软骨的骨前体中ChM-Ⅰ转录可在软骨的静息区、增殖区及早期肥大区中出现。Hiraki等[3]认为，ChM-Ⅰ转录在软骨组织中特异性表达表明了其抗血管生成特性，成熟的ChM-Ⅰ蛋白在软骨组织细胞外基质中明显累积。ChM-Ⅰ与FGF-2在软骨中分布的不同表明了ChM-Ⅰ在软骨中的抗血管生成作用，以及软骨下骨的形成过程中的抗血管生成转换作用[5]。

Kitahara等[7]研究发现，在发育期大鼠的关节软骨中ChM-Ⅰ的表达主要集中于骨软骨交界区的细胞外基质，随软骨组织的发育成熟ChM-Ⅰ表达逐渐减弱。在生长发育的各个时期ChM-Ⅰ在骺软骨主要集中在软骨静息区、增殖区和早期肥大区，而在晚期肥大区表达显著降低，在钙化软骨区则未见表达。在成熟的关节软骨中，ChM-Ⅰ的表达主要集中在深层肥大软骨细胞周围，其表达水平均显著高于关节软骨。Shukunami等[8]通过反转录-聚合酶链反应从兔生长板软骨细胞培养液中分离出兔ChM-Ⅰ前体cDNA，采用核糖核酸印迹技术分析，表明ChM-ⅠmRNA以组织特异性形式存在于软骨中。ChM-ⅠmRNA水平随着原始培养的软骨细胞的生长和分化刺激发生相应的变化。而FGF-2、转化生长因子β以及甲状旁腺激素相关肽均可显著下调ChM-ⅠmRNA在软骨细胞中的表达。

Watahiki等[9]运用荧光差异显示技术和激光微切割技术研究1周龄大鼠颚髁软骨和胫骨生长软骨的表达差异，发现在大鼠颚髁软骨内无法检测到ChM-Ⅰ表达，而在胫骨软骨中仍可检测到，表明ChM-Ⅰ在保持关节软骨无血管化过程中起到重要作用。Yukata等[10]分别检测了胫骨骨折固定后ChM-Ⅰ基因剔除小鼠(ChM-Ⅰ-/-)及基因野生型小鼠骨折愈合的差异。尽管放射学检查ChM-Ⅰ-/-小鼠骨折部位被内生及外生骨痂覆盖，但愈合延迟，骨折处Ⅹ型胶原α1表达以及软骨细胞外基质明显减少，表明ChM-Ⅰ无效突变外生软骨痂的生成减少。此外，在ChM-Ⅰ-/-小鼠骨膜愈合处的软骨细胞不能分化为成熟的软骨细胞。Fujii等[11]通过免疫组织化学技术发现，ChM-Ⅰ主要存在于内侧半月板及半月板浅层，并通过蛋白质印迹技术(Western blot)方法检测出ChM-Ⅰ仅存在于内侧半月板，ChM-Ⅰ的浓度在内侧半月板提取物条件培养液中高于外侧半月板提取物培养液，且去除ChM-Ⅰ后可使内皮细胞明显增殖。

4 ChM-Ⅰ在软骨组织外的表达及生理作用

研究发现，不仅在软骨及软骨细胞培养液中可明确检测到ChM-Ⅰ的转录表达，在软骨外的其他组织(如胸腺及眼)中亦检测到ChM-Ⅰ的少量表达[6]。Funaki等[12]研究发现，利用重组人ChM-Ⅰ(recombinant human ChM-Ⅰ，rhChM-Ⅰ)可以抑制视网膜上皮细胞管状结构的形成。Mariscalco等[13]通过对20例黏液瘤、20例风湿病患者及6例正常人的心瓣膜标本进行免疫组织化学研究发现ChM-Ⅰ表达有明显不同。Takao等[14]利用免疫组织化学的方法研究ChM-Ⅰ在软骨细胞发育及老化过程中的表达情况,证实ChM-Ⅰ在成年椎间盘的髓核、纤维环和终板软骨中均有表达且随增龄逐渐减少，随着纤维环和髓核内新生血管不断长入，椎间盘退变程度渐加重。Shukunami等[15]用含人软骨肉瘤OUMS-27细胞株的磷酸盐缓冲液0.1 mL注射至4周龄小鼠背部皮下，6 d后注射部位肿瘤生长至45 mm3后随机分为两组，实验组每日肿瘤周围皮下注射含rhChM-Ⅰ 5 μg的磷酸盐缓冲液50 μL，对照组仅注射同剂量磷酸盐缓冲液，5 d后发现实验组肿瘤体积明显缩小。

5 ChM-Ⅰ的抗血管生成作用

目前认为，ChM-Ⅰ是软骨内骨形成的血管生成转换过程中的关键物质，降低它的表达可使血管侵入性生长，由此引发软骨内骨替代的产生。推测ChM-Ⅰ在软骨内的无血管区参与了组织的快速生长和细胞外基质合成。ChM-Ⅰ可能作为依靠靶细胞双重作用的生长调节因子，在软骨内骨形成中起到关键作用。Miura等[16]实验研究rhChM-Ⅰ在小鼠角膜中的抗血管生成作用及其作用机制，结果证明，rhChM-Ⅰ可抑制VEGF-A、FGF-2、胰岛素样生长因子Ⅰ介导的人脐带血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的趋化迁移，抑制率分别为78%、71%和78%，其作用机制具有内皮细胞特异性且与细胞黏附无关；时间延迟分析进一步证实了rhChM-Ⅰ由于增加细胞出现突起的频率，细胞突起持续时间明显减少了VEGF-A刺激HUVECs的迁移距离，并且导致移动方向经常发生改变。

Klinger等[17]将一定量的ChM-Ⅰ自补腺病毒互补DNA(self-complementary adeno-associated virus carrying chondromodulin-Ⅰ complementary DNA，AAV-ChM-Ⅰ)用于微小型猪的经微骨折技术处理的受损膝关节软骨中，结果发现，感染AAV-ChM-Ⅰ的细胞可有效产生ChM-Ⅰ，并证实其抑制血管内皮细胞管状形态发生而具有强效抗血管生成的作用，基因表达分析结果认为细胞周期抑制素p21WAF1/Cip1作为靶点被AAV-ChM-Ⅰ 上调。应用AAV-ChM-Ⅰ 后刺激内生祖细胞向软骨祖细胞分化，但显著抑制终期软骨细胞肥大、血管侵入及过度的软骨内骨化。AAV-ChM-Ⅰ 感染的细胞保持软骨细胞样表型，且产生透明样细胞外基质均高于未被感染的细胞[17]。

Miura等[18]用核糖核酸印记技术分析检测出交配后6.5～9.5 d后妊娠小鼠子宫中有ChM-Ⅰ表达，原位杂交及免疫组织化学实验结果表明，ChM-Ⅰ位于成熟蜕膜包围的表达基质金属蛋白酶9滋养层基质，并且在体外实验中检测到经雌激素孕激素作用的蜕膜化子宫内膜基质中有ChM-ⅠmRNA表达，利用rhChM-Ⅰ可明显抑制不依赖基质金属蛋白酶作用的鼠，Rcho-1滋养层细胞的浸润通过基质胶和趋化迁移。Mera等[19]对含ChM-Ⅰ培养液的HUVECs、正常人真皮成纤维细胞、人肝细胞性肝癌(HepG2)细胞、宫颈腺癌海拉(HeLa)细胞进行溴脱氧尿苷渗入实验，结果表明，在平板培养液中ChM-Ⅰ对HUVECs和HepG2细胞的溴脱氧尿苷渗入抑制呈剂量依赖性，但不抑制溴脱氧尿苷对人真皮成纤维细胞和HeLa细胞的渗入，然而在软琼脂培养液中ChM-Ⅰ可抑制HeLa细胞和HepG2细胞的生长，Western blot实验分析表明，ChM-Ⅰ降低细胞周期素D1、D3和周期蛋白依赖性激酶6的水平，促进p21Cip1水平，而不影响HepG2细胞的细胞外基质蛋白信号通路下游分子胞外信号调节激酶、蛋白激酶B和糖原合成酶激酶3β磷酸化水平，双荧光素酶基因报告证明ChM-Ⅰ，抑制信号转导与转录活化因子转录水平。Miura等[20]进行人ChM-Ⅰ基因定点诱变实验研究发现，ChM-Ⅰ 第83和第99位半胱氨酸之间二硫键组成的环状结构在抗血管生成过程中起重要作用,以丝氨酸完全替换该片段则作用消失。此外，ChM-Ⅰ 的C端由第111位色氨酸至120位缬氨酸片段组成的疏水尾被证实其对于人血管内皮细胞作用过程的重要性[20]。

6 小 结

基因及蛋白质研究技术的发展揭示了ChM-Ⅰ的促软骨细胞分化、生成以及其抗血管生成等作用并越来越受到学者的重视。对其研究不仅在软骨组织及骨组织中的组织生长再生，维持软骨、椎间盘、软骨终板、角膜、心瓣膜等组织的无血管活性方面，且涉及到ChM-Ⅰ在心血管疾病和肿瘤等疾病的发生、发展过程中的作用。目前随着运用重组ChM-Ⅰ进行动物实验和对其家族成员ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ等的研究逐渐开展，将推动ChM-Ⅰ作用的受体、受体结构、理化性质以及细胞内信号传递过程和ChM-Ⅰ与各种临床疾病关系研究的不断深入。

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