线粒体丙酮酸载体与肿瘤的研究进展

李小丽，李亚青，钟亚莉，樊慧杰(综述)，张明智，索振河(审校)

(郑州大学第一附属医院肿瘤科，郑州 450052)

丙酮酸是糖类、脂肪和氨基酸代谢联系的枢纽,细胞整体代谢状态决定丙酮酸的代谢。有氧条件下，载体将丙酮酸从细胞基质转运到线粒体基质，继而被丙酮酸脱氢酶复合体转化成乙酰辅酶A和二氧化碳；在无氧环境中，胞质中丙酮酸经无氧糖酵解形成乳酸并从细胞中转出。线粒体丙酮酸载体(mitochondirial pyruvate carrier，MPC)是丙酮酸穿越线粒体膜过程中发挥重要作用的蛋白。此外，更重要的是肿瘤细胞即使在有氧的状况下，也偏好糖酵解获取能量。尽管科学届已经在多个世纪前就注意到这种现象，但其分子机制直至目前尚未明确。MPC近年来的研究为进一步研究肿瘤、肿瘤干细胞以及肿瘤细胞干性调节带来了新的契机。

1 MPC研究历程

最初认为，丙酮酸可以以非解离形式自由通过细胞内膜。随后对其生化特性评估发现，细胞内大多数丙酮酸以离子形式存在，因此推测存在转运体易化丙酮酸进出细胞膜[1-2]。后来利用无蛋白的脂质体模型研究发现，丙酮酸有直接跨膜能力[3]。但是该实验中丙酮酸浓度为100 mmol，这比细胞积聚浓度高出1000倍[4]，而且人造膜并不具有线粒体内膜的渗透性和其他特性。

1971年，Papa等[5]从大鼠肝脏中提纯线粒体，用抑制剂进行预处理后与放射物标记丙酮酸混合，在HClO4硅油微梯度介质中离心，观察丙酮酸的转运。该研究证实丙酮酸通过特定的转运蛋白跨越线粒体膜，首次提出MPC的概念，早期被命名为BRP44L和BRP44。BRP44L和BRP44分别是brain protein 44-like,brain protein 44,这是依据当时发现的蛋白表达位置命名的，而MPC是根据其功能命名的(分别代表MPC1和MPC2)，但后来证明该实验中检测的转运体为辅酶Ⅰ(即NAD+)转运体，它的活性类似于丙酮酸转运体[6]。

随后发现，煮沸变性的线粒体依然能够像正常线粒体一样积聚一定浓度的丙酮酸[7]。这项研究推测丙酮酸可能只是吸附在膜上，并未发生跨膜转运，也就是可能不存在丙酮酸转运体。但随着实验技术的逐步更新，对MPC的动力学、调控机制和分子表达的认识也在不断深化，为MPC的鉴定和功能研究提供了重要的理论依据。

2 MPC认知的发展

2.1MPC特异性抑制剂 Halestrap等[8]发现,α-氰基-4-对羟基肉桂酸乙酯(α-cyano-4-hydroxycinnamate，CHC)能与线粒体膜上特定的蛋白结合，对其进行鉴别证实CHC通过阻止线粒体丙酮酸的转运抑制丙酮酸氧化。抑制剂在完整的线粒体中发挥阻碍转运和代谢活动的作用，对破裂的线粒体没有影响。也就是说，抑制剂作用于线粒体膜，而不是作用于酶，证实了MPC的存在。其中，CHC类似物UK5099[alpha-cyano-beta-(1-phenylindol-3-yl)acrylate]，具有更强更特异的抑制作用。

Pande等[9]利用肉桂酸盐抑制丙酮酸转运。正常线粒体中积聚1 mmol丙酮酸即可发生氧化作用，但是在60 mmol丙酮酸中加入经CHC预处理的线粒体，丙酮酸不能被氧化，表明CHC作为一种非竞争性抑制剂抑制丙酮酸的转运。同时发现，当60 mmol丙酮酸存在条件下，线粒体对CHC抑制产生抵抗作用。因此证明CHC作为非竞争性抑制剂，高浓度丙酮酸(60 mmol)使细胞产生CHC抵抗。

Feinstein等[10]通过实验发现，噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)能够直接影响线粒体功能，对细胞的呼吸存在特异性抑制作用。之后,Divakaruni等[11]也证实,MPC是TZDs结合的特异性靶位点，TZDs的抑制作用能够调节细胞的糖代谢。

TZDs和UK5099均可作为MPC的化学抑制剂，两者通过不同的途径抑制线粒体丙酮酸的摄入，阻断丙酮酸氧化作用。UK5099与MPC1的硫醇基特异性共价结合，该结合不可逆，MPC将永久被抑制[12]；TZDs通过与细胞核过氧化物酶增殖物激活受体γ结合，调控脂肪储存、细胞分化、炎症反应及最重要的丙酮酸转运[13-14]，而经洗涤和透化作用后TZDs的抑制作用消失。

由于线粒体上其他转运体的存在和持续的新陈代谢，以及代谢产物对丙酮酸的转运也存在一定的影响作用，很难清楚地在整体环境中研究线粒体转运体的特性。如果能独立重构MPC基因和蛋白并实现生化提纯，将有利于对其结构和功能做出进一步研究。

2.2MPC的纯化 Paradies[15]利用标记14C的α-氰基肉桂酸与MPC作用后发现丙酮酸转运受到抑制，因此认定抑制剂、MPC和丙酮酸转运之间存在直接联系。另外，用UK5099浸泡线粒体30 min，再100倍稀释线粒体，UK5099对MPC的抑制作用无法解除[16]。从此，人们根据该实验原理利用固化抑制剂的方法提纯MPC。

Bolli等[17]利用羟基磷石灰层析和识别特异性蛋白的方法，建立了一套精确的重建MPC方法。实验中，使2-氰基-4-羟基肉桂酸与琼脂糖共价结合。利用羟基磷石灰提纯后，线粒体片断通过肉桂酸柱，其中34×103和31.5×103的蛋白质被留下来[17]。在牛的心脏和大鼠肝脏的研究中发现，(29～37)×103范围大小的蛋白质具有催化丙酮酸转运的功能[18]。MPC提纯技术的成熟，为载体独立系统的构建奠定了坚实的基础，促进MPC的认知发展。

3 MPC的基因组成、蛋白结构和功能

人MPC是由MPC1和MPC2组成的复合体。MPC1的基因组DNA全长18 095 bp，含有5个外显子，位于6q27；MPC2基因组全长20 312 bp，含有5个外显子，位于1q24.2。MPC1和MPC2在线粒体膜上拥有两个跨膜α螺旋，两者共同构成的异质二聚体组成具有丙酮酸转运功能的线粒体丙酮酸转运复合体，该复合体蛋白相对分子质量约为150×103。

近期发表在科学杂志上的文章进一步揭示了MPC的生物学特性。Bricker等[19]从高度保守的线粒体蛋白着手，剔除或沉默哺乳动物MPC基因，细胞糖分解中间产物和丙酮酸增多，伴有乙酰辅酶A和三羧酸循环代谢物减少。Herzig等[20]针对细胞硫辛酸合成缺陷与缬氨酸和亮氨酸缺乏的生长缺陷对MPC进行识别和功能表达研究。这两个方法和策略从完全不同的实验得出了相同的结论：MPC是由多种蛋白组成的复合体。

Bricker等[19]利用非变性凝胶电泳和免疫沉淀法证明载体蛋白相互作用形成大的复合物，但MPC1和MPC2的相对分子质量不同。另外，从丙酮酸代谢缺陷患者中识别出两处关键性基因突变[21]。测序研究显示两处突变发生在MPC1高度保守区域，代谢研究发现使表达野生型MPC1可以治愈丙酮酸代谢缺陷[22]。这些数据有力地证明了MPC1/MPC2复合体是线粒体丙酮酸转运体的主要组成部分。

Herzig等[20]从Pfam数据库中识别出一个膜蛋白家族，它们对于把丙酮酸运输进线粒体是充分而且必要的。此家族被重新命名为MPC家族。研究者从小鼠肝中识别了该家族的两个成员——MPC1和MPC2。两者均为线粒体内膜蛋白，都拥有两个跨膜α螺旋。小鼠MPC1和MPC2还与酵母菌线粒体内膜的MPC1、MPC2和MPC3具有序列相似性。继而以酿酒酵母菌为模式生物探讨MPC家族蛋白质的功能，发现MPC1缺失或者MPC2和MPC3联合缺失的酵母菌细胞在氨基酸培养基中生长减慢，而表达MPC1基因可恢复其生长速度。另外，研究者在乳酸乳球菌中共表达小鼠的MPC1和MPC2，发现可促进丙酮酸的跨膜运输，并且这种促进作用随线粒体膜内外的电化学梯度减小而减弱[20]。上述观察结果有力地证明了MPC家族分子尤其是MPC1和MPC2对线粒体的丙酮酸运输起关键作用[20]。

线粒体转运丙酮酸是葡萄糖氧化、脂肪生成、糖异生和一些氨基酸合成的基础。大多数代谢酶存在于线粒体基质中，而线粒体内膜在代谢产物与基质接触过程中发挥重要的调控作用，通道的缺乏将阻碍丙酮酸的代谢。MPC调控丙酮酸的转运，影响糖代谢、能量产生和其他营养物质的转化。

4 MPC功能表达异常相关的疾病

对三个无血缘关系的家庭进行人类基因组测序，发现患有乳酸酸中毒的儿童MPC1发生突变，使成纤维细胞表达野生型MPC1将修复丙酮酸依赖的细胞呼吸作用[22]。对具有代谢障碍疾病的患者MPC基因进行测序，有利于在临床上选择合适的饮食或药物进行治疗。

数年来，对哺乳动物MPC分子特性的认识仍然很少，但多数研究探讨了MPC与糖异生、激素和药物的调控机制、甲状腺功能亢进、老化和糖尿病等病理状态的联系，证明了MPC的生理意义和调控机制。对于先天性代谢缺陷疾病的临床研究发现，MPC缺陷和丙酮酸脱氢酶复合体突变的临床表现相似[19,21]。对于那些怀疑丙酮酸脱氢酶复合体基因突变但酶活性正常的患者，很可能其MPC已经发生了突变。MPC缺陷或被抑制的细胞出现丙酮酸转运障碍，但通过添加甲基丙酮酸可以改变这一状况，这也是区别丙酮酸脱氢酶复合体缺陷和MPC功能异常的方法[11]。

5 MPC与肿瘤关系

当前对肿瘤代谢的研究热点包括肿瘤细胞糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循环和低氧条件下细胞因子的表达等。但是，截至目前为止肿瘤丙酮酸转运的动物模型还未见报道。有文献提示，MPC缺陷不仅可以导致代谢障碍，也可导致肿瘤病理生理学意义上的代谢改变[22-24]。

SAGE数据库分析发现，基因BRP44在前列腺癌组织的表达数据库中高表达,超过癌周围正常组织的10倍。同时在人体所有肿瘤及正常组织中,BRP44在前列腺癌组织的表达强度最高；在雄激素依赖型的人前列腺癌(lymph node carcinoma of prostate，LNCaP)细胞系中高表达而在雄激素非依赖性人前列腺癌(prostate cancer-3，PC-3)细胞系中不表达。提示BRP44可能是一个与前列腺癌发生、发展密切相关的上调表达基因[25]。抑制BRP44在LNCaP细胞中的表达后,LNCaP细胞的增殖能力增强[24]。BRP44-PC3细胞较正常PC3细胞有更强的DNA合成能力、细胞分裂增殖能力和侵袭力[26]。研究证实，MPC缺陷促进糖分解代谢。与正常肝脏细胞相比，艾氏瘤细胞的线粒体丙酮酸转运体活性极低，而糖分解较快，提示MPC表型发生改变[23]。艾氏腹水细胞、莫里斯肝癌44细胞和莫里斯肝癌3924A细胞与正常大鼠肝脏细胞相比，癌细胞转运体的最大转运速率下降，参与呼吸作用的丙酮酸减少，跨膜pH梯度变小。因此认为，载体减少引起转运体活性下降，造成丙酮酸代谢缺陷[27]。

对线粒体丙酮酸转运与肿瘤代谢两者之间关系的认识很少，它们之间的关系和影响很有趣。肿瘤细胞常常活跃地摄取葡萄糖，进行有氧糖酵解，即瓦伯格效应[28]。这种消耗大量能量供应肿瘤细胞生长的方式是必需的，它为肿瘤细胞的不断生长提供能量和生物合成的原料。已有研究表明，多数肿瘤细胞都存在不同水平的糖酵解关键酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶和丙酮酸脱氢酶活性的异常[29-30]。这些异常与肿瘤细胞的有氧糖酵解即瓦伯格效应增强有关。乳酸脱氢酶、M2型丙酮酸激酶和丙酮酸脱氢酶直接影响丙酮酸代谢，也间接地影响丙酮酸进入线粒体的速度[31-33]。因此有理由推测，MPC在肿瘤相关的丙酮酸代谢调控中发挥重要作用。

6 MPC与肿瘤细胞的干性调节

目前对肿瘤细胞MPC的表达及其功能的研究还很有限。但是已有研究发现肿瘤细胞在低氧情况下可以通过上调其干性(stemness)获取生存能力以及化疗耐药特性[34-36]。对前列腺癌和食管癌细胞系体外不同氧浓度下干细胞特性的研究发现，肿瘤细胞在低氧情况下可以相应上调缺氧诱导因子，从而干细胞相关因子上调[35-36]。低氧的微环境与肿瘤细胞的干性维持密切关系，而低氧的条件也迫使细胞通过糖酵解的方式产生能量,提示其他迫使肿瘤细胞进行糖酵解的途径同样可能会增加肿瘤细胞的干性水平。然而前列腺癌LNCaP细胞系中MPC2高表达的报道提示，活跃的丙酮酸氧化磷酸化可能是肿瘤组织的特性之一[23]。在组织氧气供应正常情况下(多数肿瘤周边的或者靠近血管的肿瘤细胞)，肿瘤细胞的MPC高表达，后者MPC功能上扬，从而肿瘤细胞生长活跃。然而，瓦伯格效应不应该是所有肿瘤细胞所具有的特性，而是某些肿瘤细胞，如肿瘤团块中心缺氧的部分或者远离血管的部分肿瘤细胞，以及当肿瘤细胞在遭受化疗/放疗等打击的情况下主动关闭氧化磷酸化程序，并且开启糖酵解途径，从而获取了更大的细胞干性，增强了细胞抵御极端环境因素打击的那些肿瘤细胞的特有能力。如果该假设可以被进一步证明的话，针对MPC和肿瘤干细胞的研究一定会有积极的意义。

7 结 语

MPC在葡萄糖氧化、脂肪生成、糖异生和部分氨基酸合成中发挥重要作用，主要是因为MPC是丙酮酸在细胞内转运的基础蛋白，决定丙酮酸代谢的去路。MPC缺陷能够引起类似丙酮酸脱氢酶复合体基因突变的临床表现，如乳酸酸中毒和早发性、退行性神经变性病等。MPC表达异常也可导致肿瘤病理生理学意义上的代谢改变。近年来对MPC基因及其功能的进一步研究提示，MPC在肿瘤组织的瓦伯格效应中可能起着重要作用，而MPC的功能状态也可能与肿瘤细胞的干性调节密切相关。因此，加强对肿瘤细胞体内以及体外MPC的研究可能会揭示肿瘤干细胞治疗新的途径。

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