血脑屏障结构功能及体外模型的研究进展

周曼，杨万超，刘翔，于淼综述 李文志审校

综述

血脑屏障结构功能及体外模型的研究进展

周曼，杨万超，刘翔，于淼综述 李文志审校

血脑屏障；脑微血管内皮细胞；星形胶质细胞；周细胞

血管与脑、脊髓细胞外液之间存在的一个调节界面，即脑屏障。由血脑屏障(BBB)、血—脑脊液屏障(BCSFB)和脑脊液—脑屏障共同组成。脑屏障仅允许必需的代谢物质进入，阻止和移除不需要的代谢产物或毒性物质[1]，使中枢神经系统能够在脑外环境不断动态变化的情况下，保持神经组织的正常活动及内环境的稳定[2]。3个屏障中，BBB最为重要。BBB是血液和CNS之间物质交换的基础并具有精密的解剖结构，其完整性无论是在生理还是病理情况下都是极其重要的。BBB具有诸多重要作用，包括为脑部必需营养物质提供运输通道，调节代谢产物的流出，限制离子和液体在血液与脑之间的运输等。目前对BBB的研究已成为众多学者关注的焦点，此类研究中的绝大部分均是借助BBB体外模型来完成的。本文将从BBB的结构、功能及体外模型的建立三个方面介绍BBB对CNS乃至整个机体的作用。

1 BBB的结构

BBB由复杂的多种细胞构成，其功能依靠各种细胞间的相互作用共同完成。BBB的基本结构包括脑微血管内皮细胞(BMEC)及其间的紧密连接(tight junctions, TJ)、基底膜和星形胶质细胞终足、周细胞和狭小的细胞外隙[2]。基底膜、小胶质细胞、星形胶质细胞、BMEC以及神经元共同组成神经血管单元(neurovascular unit,NVU)。NVU对于中枢神经系统的内环境稳定和生理功能的维持是至关重要的。

1.1 BMEC 不同于其他血管床上的内皮细胞，BMEC具有其独特的特点：内皮细胞薄，无窗孔，细胞之间存在紧密连接，很大程度限制了蛋白及离子的通过；内皮细胞带负电，故导致带负电的物质不易进入脑组织；BMEC线粒体的含量为其他组织内皮细胞含量的3倍，因此其代谢活跃，能够为脑细胞提供主动转运物质的能量。

1.2 TJ TJ通过严格限制BMEC及外周血之间物质的流动性以维持中枢神经系统内环境的稳定性[3]。TJ具有精细的结构，其通过延长上皮与BMEC间隙间的顶端区域发挥以下两方面的作用：一方面作为一种“拉链”结构有效地分开细胞膜的顶部和底部，从而造成细胞膜上成分的不均匀分布；另一方面作为一种“栅栏”结构限制细胞间的通透性。紧密连接对细胞间的信号传导反应十分迅速并且具有高度动态的结构，可以迅速改变表达方式、亚细胞定位、翻译后修饰，从而影响蛋白与蛋白间的相互作用。紧密连接蛋白在维持BMEC之间相互作用的稳定性方面所起到的作用越来越受到关注[4]。

1.3 基底膜 基底膜是特异的细胞外基质。基底膜的生物学活性对内皮细胞的生长发育、分化和功能维持都有重要影响。基底膜的主要结构成分包括IV型胶原蛋白、与胶原蛋白连接的层粘连蛋白(laminin, LN)和纤维连接蛋白(fibronectins, FN)、巢蛋白(nidogen-1)以及蛋白多糖等。基底膜具有定位细胞和为脑部固有细胞之间提供联系的作用。星形胶质细胞、周细胞及BMEC都是基底膜的组成部分[5]。BMEC外面的基底膜较其他部位的基膜厚，为血管基膜与神经上皮基膜的融合。基底膜的破坏将会影响BMEC上紧密连接蛋白的表达并且在许多病理情况下会增加BBB的通透性[6]。

1.4 星形胶质细胞 星形胶质细胞可以诱导BMEC发挥有效的屏障功能。脑毛细血管壁上有星形胶质细胞深处的脚板黏附，形成胶质膜，包绕毛细血管基膜的85%，能够阻挡部分大分子物质通过，同时还有主动运输某些物质的功能。另外，星形胶质细胞是许多调节因子如TGF-β[7]、GDNF、bFGF、IL-6等的重要来源。

1.5 周细胞 周细胞是环绕紧贴于毛细血管和毛细血管后微静脉壁外周的一种结缔组织型的细胞，除BMEC外，周细胞是脑微血管另一种重要的壁细胞，与BMEC有共同的基底膜，为脑微血管提供机械支持。周细胞内含有收缩性蛋白而被认为与血管收缩有关[8]，对视网膜的屏障功能及起着重要的作用[9，10]。

2 BBB的功能

BBB是维持脑内环境稳定的选择性血管屏障，可动态反映BMEC的生理活动。相邻的BMEC间紧密连接的存在构成了BBB的一层物理屏障，阻止细胞间的分子通过BBB。通过位于内皮细胞膜内外的特殊转运系统，BBB允许和促进所需的营养物质通过，并且排除和阻止有潜在危害性的物质通过，因此BBB也可以作为一个选择性的转运屏障。BBB同时可作为一道代谢屏障[5]，屏障上细胞内和细胞外的酶类(乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、单胺氧化酶)具有灭活神经刺激性及毒性物质且可以促进肽类及ATP代谢的作用。以上任何功能的失调都将会导致中枢神经系统活性下降及功能障碍[11]。BBB功能的变化与许多病理过程密切相关，如屏障功能的破坏会引发诸多中枢神经系统疾病包括感染和炎性反应[12]、休克、多发性硬化症[13]、阿尔兹海默病[14]、帕金森病、脑水肿、青光眼[15]等。BBB的功能障碍可能与屏障慢性损坏所致的紧密连接功能的破坏及暂时性开放有关。这些中枢神经系统疾病的发生是否由于BBB的损坏所致目前仍不明确，但可以证实的是屏障损坏可以加剧病理过程的进展[16]。

BMEC是构成血脑屏障的基础，在缺氧等病理损害中，内皮细胞往往是损害的直接靶细胞，并且缺氧还会引起一系列细胞生长内环境的变化。BMEC以细胞间的TJ为主要特征,细胞外的基底膜是连续的，胞饮作用很微弱、缺少窗口结构、无Weible-Palade小体。这些是BBB的主要结构基础，防止大脑被血液内的微生物和毒素所伤害[17]。有害物质在通过BMEC时会受到胞浆内酶系统的作用而破坏，因此即使能够进入BMEC却不能通过血脑屏障而进入脑实质。

最近有研究证明星形胶质细胞在脑缺血缺氧和维持屏障功能方面对BMEC起到辅助作用并促进其发挥保护作用[18]。有研究证实周细胞可能参与了物质通过BBB的过程[19]。在缺血缺氧过程中，星形胶质细胞和/或周细胞分泌转化生长因子、促红细胞生成素、神经胶质衍化神经营养性因子以及神经营养因子等多种因子，反映了损伤调节因子的多样性，并且这些因子可以提高屏障功能及BMEC在损伤过程中的存活率。然而，近期有研究表明由于损伤的程度和持续时间不同，每种细胞在维持屏障功能方面所起的作用也是不同的[19]。例如在急性缺氧性损伤过程中星形胶质细胞对BMEC屏障的保护作用强于周细胞，而在慢性缺氧性损伤过程中周细胞则比星形胶质细胞具有更强的保护作用，这可能是由于信号通路的调节机制不同以及血管内皮细胞因子等的释放所导致的[19]。

体外模型研究证实周细胞可以提高BBB的功能[20, 21]。周细胞表面有血小板生长因子(PDGF-B)表达，它由BMEC分泌并且对脑血管的形成十分关键，血小板生长因子基因的破坏会导致周细胞的缺失、BMEC增生，并且增加新生儿致死率[22, 23]。在敲除周细胞的大鼠模型中已证实周细胞在功能调节方面起到重要的作用，包括TJ的形成，中枢神经系统内皮细胞的囊泡运输，星形胶质细胞的极化以及维持细胞间功能的完整性[24]。此外，在周细胞缺失的大鼠体内，年龄依赖性的血管损害要先于神经元变性、学习及记忆功能病损以及神经炎性反应的发生[25]。因此，周细胞调控的主要神经血管功能对BBB及固有神经元结构及功能的维持是十分必要的。

3 BBB的体外模型

关于BBB的许多研究都是借助体外模型来实现的，体外BBB模型的建立可满足许多实验对血脑屏障进行精细调节的要求，不但加深了对BBB物质流动调控过程的了解，还能帮助我们更加透彻地理解屏障功能的调节、生理及病理的变化过程。相对于体内模型，体外模型具有功能多样性、相对简单性、耗资较低等优点，因此在近期的研究中被更加被广泛地应用。

3.1 MDCK(Madin-Darby canine kedney)细胞模型 曾有学者利用非脑部来源的MDCK细胞进行BBB体外模型的研究，MDCK细胞间具有良好的通透性等特点，然而与脑内皮细胞之间仍存在许多差异[26]。MDCK中紧密连接蛋白以claudin-1为主，而BMEC中则为claudin-5；在MDCK细胞中表达的ZO-3在BMEC中则没有表达。许多结构及蛋白表达上的差异导致MDCK细胞所制备的BBB模型在研究过程中与实际BBB对药物等的通透性及代谢物质转运过程有很大差异，现已很少应用。

3.2 HUVECs(Human umbilical endothelial cells)模型 人脐带血内皮细胞在BBB模型制备过程中也被频繁使用[26]，HUVECs为人体来源的细胞，在BBB研究过程中易于将体外研究成果还原于体内，但是由于HUVECs亦不是脑组织来源的细胞，一些紧密连接蛋白、通路、受体与BMEC的表达也不尽相同，因此研究价值低于BMEC模型。

3.3 永生细胞模型 在早期BBB体外模型的构建过程中也曾利用永生细胞进行模型制备，此模型不仅可以避免原代细胞提取过程的繁琐步骤，也排除了其他细胞的污染，有利于细胞的纯化[27]，但是永生细胞构建的体外模型不能完全体现BBB的特点，并且失去了BBB重要的屏障功能，所以目前很少应用。

3.4 BMEC模型 从BMEC单层培养到BMEC与星形胶质细胞(T1A)共同培养的二维(2D)模型，再到此2种细胞与周细胞共同培养的三维(3D)立体模型，其造价、性能也大不一样。目前被应用的是2D和3D模型，它们分别有各自的优点和缺点。

3.4.1 二维模型(2D)： 20世纪80～90年代，许多学者开始尝试将BBB中2种主要细胞(多数为BMEC与星形胶质细胞)进行共同培养，在逐渐摸索中形成了当今被广泛应用的BBB 2D模型。2D模型能够充分体现内皮细胞的屏障作用，这种模型可以用于许多方面的研究，包括药理学研究[28]，物质的转运、迁移以及代谢等研究。模型制备是通过原代培养BMEC和脑星形胶质细胞，并借助Trans-well 小室构建2种细胞共培养模型，待2种细胞融合80%后，进行屏障功能鉴定后即可作为体外BBB的研究。

3.4.2 三维模型(3D)： BBB上的各种细胞均有自身独特的空间定位，这是细胞之间进行相互作用以及维持BBB屏障功能的基础。因此，学者们基于此制备了BBB的3D模型。3D模型所反映的细胞间的移动以及动态的相互作用与体内更加相似。此模型丰富了对BBB特性的相关知识，同时在展示BBB结构的复杂性的研究中更具有代表性。模型制备是将BMEC、星形胶质细胞和周细胞共同培养成为管状结构，进行屏障功能鉴定及检测后可用于相关实验的研究。

由于单层细胞模型跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance， TEER)较低，与体内实际数值差距较大且模型渗透性较高，体内外相关性较差，因此现在很少应用；而三维模型由于培养复杂、成本较高，没有被广泛利用。目前比较通用的BBB体外模型是按照其在体内的解剖结构将BMEC和星形胶质细胞进行共培养。大量研究表明星形胶质细胞在BBB功能维持方面有辅助作用。自从BMEC与星形胶质细胞之间的相互作用被广泛利用，BMEC与星形胶质细胞共培养模型已经成为BBB研究领域最为普及的模型，其特点是可以直接反映BBB的功能状态及细胞间的相互作用，并且不受其他生理因素的影响。此模型具有较高的跨内皮细胞电阻值、较低的通透性以及表达多种转运蛋白。它不仅适用于基础实验的研究，在临床药物选择实验中也有着不可替代的作用。

然而，体外模型不可能全面还原体内模型的各种特性并且会限制BMEC的许多功能。从体外模型中获得的实验数据需要考虑到不同细胞对实验结果的影响，还要考虑到细胞间的相互作用以及体内和体外模型之间的差异。尽管体外模型可以提高我们对屏障功能的认识，但将体外模型的研究成果还原于体内并应用到实际临床实践中的可能性仍有待观察，这也成为了诸多学者今后的研究方向。

BBB是一个动态系统，能够反映脑内的局部变化以及物质需求，可以通过一系列的转导途径及细胞间的相互作用来调控大脑在生理及病理情况下的功能，如调控紧密连接蛋白的功能以及多种转运蛋白和酶类活性的表达。在保护循环物质，调节营养供需以及修饰局部修复等方面，BBB的调节是迅速且有效的。值得强调的是BMEC及其相关细胞在BBB功能调节过程中起着重要的作用。尽管对于BBB在结构和功能上有了一些了解，但就机体的复杂性所导致BBB的其他功能特性还有待进一步探讨。

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国家自然科学基金资助项目(№.81171076)

150086 哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科(周曼、李文志)；黑龙江省麻醉与危重病研究重点实验室(杨万超)； 黑龙江省高校麻醉基础理论与应用研究重点实验室(刘翔、于淼、李文志)

李文志， E-mail：wenzhili9@126.com

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.039

2013-09-27)