端粒酶和PTEN在大肠癌中的研究进展

段晓燕，陈 平(综述)，冷雪芹(审校)

(内蒙古医科大学附属医院消化内科，呼和浩特 010050)

近年来,我国结直肠癌发病和死亡均呈上升趋势[1]，发病率和病死率均高于世界平均水平[2]，早期诊断对结直肠癌的预后非常重要。其发病的病因尚不十分清楚，其发生、发展及转移过程中细胞凋亡基因和抑癌基因异常表达是目前研究的热点。端粒酶是一种高度特异化核糖蛋白复合体，为端粒DNA延长提供RNA模板序列，维持端粒长度的稳定，赋予细胞无限增殖的能力，具有抑制细胞凋亡的作用，在肿瘤进展中起着关键的作用。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一种抑癌基因，与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。该文就国内外对端粒酶和PTEN在大肠癌中的研究进展予以综述。

1 端粒酶

1.1端粒酶及其在肿瘤中的作用机制 端粒酶是一种端粒特异性末端转移酶,它能以端粒DNA的3c末端为引物、以自身RNA为模板、特异性地把端粒DNA重复序列(TTAGGG)加到染色体末端，以补偿DNA不完全复制造成的端粒缩短，从而维持端粒长度和染色体稳定。端粒酶主要由人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcnptase,hTERT)、端粒酶结合蛋白1三部分构成[3]。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。在正常细胞中，端粒的结合蛋白和相关蛋白对端粒长度具有反调节作用，可抑制端粒酶活性[4]。极少数变异细胞重新激活端粒酶，借其稳定染色体末端结构的功能，使其跳过凋亡临界状态，成为不死细胞。不死细胞很多会包含由于端粒末端联接而导致的染色体畸形。因此，端粒酶活性是细胞永生化及恶性肿瘤发生的关键性因素[5]。在人的肿瘤细胞中，通过变异的端粒酶RNA模板表达，激活端粒酶活性。端粒功能障碍也可以因癌基因的激活而引发，导致没有端粒缩短的DNA损伤反应和细胞周期阻滞[6]。可能由于DNA损伤无法修复，端粒最先成为DNA损伤的信号分子积累的部位[7-8]。最近有学者提出，肿瘤的发展是一个危机-重建-再危机-再重建过程[9]。端粒损耗使细胞发生复制危机，引起细胞增生障碍和器官萎缩，p53失活使细胞绕过危机，基因重组后的癌细胞通过激活端粒酶维持癌细胞的生长和转移。

1.2端粒酶在大肠癌中的表达 目前对端粒酶在结直肠肿瘤中表达状况已作了较多研究，发现其与结肠癌的分期、病理生物学行为密切相关。Vidaurreta等[10]发现微卫星不稳定性与端粒酶活性之间无明显关系，但端粒酶阴性结肠癌患者的生存率要比端粒酶阳性结肠癌患者高。Lam等[11]发现有肿瘤转移的患者及直肠癌患者的hTERT高度表达，与肿瘤的远距转移有关，因此通过对hTERT蛋白水平的检测，进而推测端粒酶可作为肿瘤生物学侵袭行为的预测指标。另有研究人员发现，15%以上的癌前病变可以检测到端粒酶活性[12]。例如，在对肠息肉的研究中发现，端粒酶的激活促使息肉细胞不断增殖为永生化细胞，最终进展为恶性肿瘤[13]。还有学者发现散发结直肠腺瘤患者，端粒酶反转录酶可能是癌形成的最好的预测物[14]。复发腺瘤比原发腺瘤更具有癌变危险性，尤其息肉越大，息肉数越多的患者，癌变率越高[15]。端粒酶的高表达在大肠癌的浸润、转移、发生及发展中可能起重要作用，其可作为反映大肠癌生物学行为的一项指标，在诊断、预后、复发的评估中有一定参考价值。

1.3抑制端粒酶活性在大肠癌中的应用 近年来端粒酶作为抗肿瘤治疗的一个理想靶点，渐渐成为恶性肿瘤治疗的研究热点。有实验报道，应用hTR基因反义核苷酸药物、反义hTERT表达质粒或者靶向hTERT基因RNA干扰技术可以明显抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞的生长和生殖。

端粒酶抑制剂Geron Presentations on Imetelstat(GRN163L)的出现备受关注。其独特抑制端粒酶活性的作用及其联合目前的抗肿瘤方法的研究，取得了很大的进展[16]。GRN163L是一种针对hTR基因反义核苷酸药物，其所拥有的N3′到P5′的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸化学骨架，能够沉默hTR基因的5′-CUAACCCUAAC-3′核苷酸序列，从而具有强而特异抑制端粒酶的活性，造成肿瘤端粒长度缩短[17]。当端粒缩短到一定程度时，肿瘤细胞出现衰老、凋亡等改变[18]。

Yang等[19]应用反义核酸技术将反义hTERT表达质粒转染胃癌细胞SGC-7901，使胃癌细胞端粒酶的活性降低了75%，而且使该细胞的端粒在60个细胞周期之后从4.08 kb缩短到3.35 kb，该转染细胞异型减少，接触抑制恢复，密度抑制恢复，体外入侵能力下降，G0/G1期细胞和细胞凋亡增加。更重要的是在软琼脂中无克隆形成，裸鼠体内成瘤性消失。刘祥厦等[20]设计合成靶向hTERT基因的表达载体，转染人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231，结果转染后细胞端粒酶的活性下调，且抑制肿瘤细胞增殖。RNA干扰(RNAi)是一种阻滞内源性基因表达的方法，由双链RNA诱导的发生在转录后水平的基因沉默。袁超君等[21]应用靶向hTERT基因的小分子干扰RNA(siRNA)，用脂质体转染法将其导入大肠癌细胞株HT-29，结果发现，siRNA可以特异性抑制大肠癌细胞hTERT的活性，降低了细胞hTERT 信使RNA(Mrna)的表达，下调了细胞hTERT的蛋白表达，抑制大肠癌细胞的增长，促进肿瘤细胞的凋亡，为大肠癌的基因治疗提供了实验依据。

2 PTEN

2.1PTEN概述及在肿瘤中的作用机制 抑癌基因PTEN包括一个C端C2区域，一个N端磷酸酶区域和C端区，编码为一种由40个氨基酸组成的蛋白质，具有脂性磷酸酯酶和蛋白性磷酸酯酶活性，在维持正常的物质代谢和内环境自稳态及细胞的多种生命活动中具有重要的功能，参与细胞的生长、聚集、黏附、迁移及凋亡以及血管的生成。

肿瘤血管生成是肿瘤发生、发展过程中的一个关键因素。随着对PTEN与肿瘤关系的深入研究，人们发现它可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路，调控缺氧诱导因子1，血管内皮生长因子等，起到抑制肿瘤血管生成的作用。同时因其具有脂质磷酸酶活性，具有脱磷酸作用，降低三磷酸磷脂酰肌醇水平，阻断了PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路，进而抑制了肿瘤的增殖、黏附、侵袭、转移和扩散。

2.2PTEN在大肠肿瘤中的表达 国内外已有较多学者对PTEN在大肠肿瘤中的表达进行了研究。Hafsi等[22]发现，PTEN的过甲基化导致PTEN低水平转录及PTEN蛋白的减少甚至缺失，从而引起胃肠道上皮过度增生进而形成肿瘤。Hsu等[23]发现，PTEN的缺失与结直肠癌化疗敏感性、病理学分期与存活率关系密切。Sawai等[24]研究表明，PTEN缺失在散发性结直肠癌患者中发挥着重要作用，PTEN的低表达可能导致肿瘤复发。在发生肝脏转移的大肠癌患者中，PTEN缺失的患者预后比PTEN正常表达的患者差。Waniczek等[25]已经证明腺瘤性息肉中PTEN低表达或完全缺失分别占41%和5%，认为是大肠癌的早期癌前状态，而且在良性病变中也发现有PTEN表达的缺失。另有研究表明，PTEN表达与大肠癌的浸润程度、淋巴结转移、分化程度及Duke′s分期有关[26]。

2.3PTEN在肿瘤治疗中的应用 PTEN基因在直肠、结肠癌细胞中被证实能抑制肿瘤生长并诱导其凋亡[27]。野生型PTEN基因的替代疗法是PTEN抑癌基因治疗的基本方法，主要是通过转基因技术将野生型PTEN基因导入恶性肿瘤基因组中，替换肿瘤细胞中突变的PTEN基因，发挥正常PTEN基因的抑癌功能。Mayo等[28]的实验显示，PTEN基因可以增加p53的活性、p53靶基因的表达和诱导细胞周期阻滞，并减少细胞核内野生型p53的降解，保证p53对细胞的生长抑制作用，并显示PTEN转导胶质瘤细胞系U87能增加抗癌药依托泊苷诱导的细胞死亡。

很多业内学者发现，在肿瘤基因治疗上PTEN基因联合某些治疗因素疗效优于单因素疗法[29-30]。Tanaka等[31]也证实了这一观点，他们将携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)导入人前列腺癌细胞株PC-3后注入多柔比星，并以PTEN基因或多柔比星等单因素疗法作对照，发现联合治疗的疗效著显高于单因素疗法。因此提出，PTEN基因和多柔比星的联合治疗可提高对PC-3基因治疗的疗效。

设计的靶向药物旨在特异性干扰特殊癌基因信号通路的活性，打断肿瘤生长。近来研究显示[32-35]，PTEN异常引起PI3K/PKB信号转导通路的激活与许多靶向药物无效有关，如针对第二人体表皮生长因子受体的曲妥珠单抗、针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和单克隆抗体西妥昔单抗等。张志宏等[36]发现，存活蛋白siRNA作用于结肠腺癌SW620可使存活蛋白mRNA和蛋白的表达下调，同时使PTEN的表达上调，两者呈负相关，同时抑制细胞的增殖及促进细胞发生凋亡。

3 端粒酶与PTEN在肿瘤中共同表达的意义

目前有些学者对肿瘤细胞中端粒酶和PTEN表达的相关性进行了研究[37-38]，探讨两种基因在肿瘤发生、发展及复发、转移、预后的作用，为患者在治疗方案上的选择及预后判断提供参考。

近年来，研究表明转染野生型PTEN基因也能够抑制肿瘤细胞端粒酶活性[39]。考虑到肿瘤侵袭特性与端粒酶活性有密切关系，而PTEN抑癌基因具有抗侵袭作用，PTEN基因是否有抑制肿瘤增殖和端粒酶活性作用？有实验结果表明，外源性PTEN抑癌基因导入高转移性黏液表皮样癌细胞能够诱导癌细胞增殖抑制，并且导致端粒酶活性显著下降[30]。文献报道，PTEN抑癌基因抑制端粒酶活性的机制可能是通过抑制PKB活化，下调端粒酶关键组分hTERT mRNA水平，进而导致端粒酶活性降低[32]。但是，国内外有关两者关系的研究较少，故要明确两者联系的具体机制仍然需要大量分子生物学实验及临床研究。

4 结 语

大肠肿瘤的发生、发展是多个基因及蛋白分子相互作用的过程，寻找判断其预后的分子生物学标志物，对指导大肠肿瘤的治疗有着重大意义。鉴于目前尚无一种肿瘤标志物在敏感性、特异性方面均理想的状况，进行联合检测是提高恶性肿瘤诊断价值的重要方法。PTEN抑癌基因可能通过抑制端粒酶活性抑制肿瘤的发生、发展，具体作用机制和生物学作用仍需进一步研究，所以研究两者在大肠癌中的表达有望为大肠肿瘤的早期诊断、治疗方案的制订提供重要的参考。

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