肿瘤高甲基化基因1在恶性肿瘤中的调控

李 旭(综述)，刘连新(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院普外六科，哈尔滨 150001)

肿瘤高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1，HIC1)定位于染色体部17p13.3位点、肿瘤抑制基因p53远端。这个基因可以编码一个转录抑制因子，并且广泛存在于正常组织中，但是在不同的肿瘤组织中，由于其高甲基化而低表达。染色体区域的高甲基化导致HIC1的继发性失活，继而在肿瘤形成时期促进信号通路或相关转录因子以及肿瘤细胞的活力。体外研究证实，HIC1的功能主要是特异的转录抑制因子，可被组蛋白脱乙酰基酶依赖或非依赖辅阻遏物复合物失活[1]。此外，HIC1在肿瘤发展中的作用已经被HIC1缺陷小鼠模型和p53、Ptch1异性结合体模型所证实[2]。肿瘤微环境中提取的潜在因子可能通过后天修饰来调整HIC1的表达，从而引导肿瘤的生成。

1 HIC1基因结构和功能区

1.1HIC1基因结构 目前，研究发现人和鼠HIC1基因外显子-内含子结构十分相似[3]。人HIC1转录可以开始于P0、P1和P2三个启动区，可以引发三个交替的第一外显子1a、1b和1c，随后的是第二编码外显子，包括3′末翻译区。外显子1a和1c与主要的GC富集启动区P1和P2分别相关并且未编码，而外显子1b与 P0 TATA box启动区相关且部分编码。外显子1b包含一个ATG′密码子，这个密码子定位于外显子2的ATG启动密码子框架中。两个新的转录因子1d和1e来自于外显子1c中的附加衔接产物，而且均由启动区P2转录而来。非拼接的转录因子1f是外显子1b中的ATG′转录而来，但是终止于非拼接内含子序列的TGA终止密码子[3]。简而言之，6个HIC1转录物(1a～f)是产生于三个不同启动区。

1.2HIC1蛋白结构 HIC1基因剪接变体可以导致各自的蛋白异形体。主要的1a型转录物经由外显子2的开放框架直接合成一个714氨基酸的蛋白编码。1b型转录物能够编码一个包含19个附加N端氨基酸的特异蛋白(12个来自外显子1b和7个来自外显子2的5′序列)。非拼接转录物1f通过内含子的未成熟终止密码子可以合成一个22个氨基酸的多肽。

HIC1蛋白的N端锌指蛋白含有120个氨基酸，是二聚体化功能域，通过构象变化直接或间接作用与蛋白质相互作用。这个区域还包含一个自发转录抑制区。HIC1的效应元件定位于它的靶基因的启动区。最近，Pinte等[3]证实了序列5′-C/GNGC/GGGGCAC/A CC-3′是HIC1最佳结合位点。有报道称，B细胞淋巴瘤6的BTB/POZ区通过特殊方式直接互补核辅阻遏物或视黄酸和甲状腺激素受体沉默调节子复合物，但是它对制滴菌素A不敏感[4]。HIC1 BTB/POZ区能够直接结合class Ⅲ组蛋白去乙酰化酶的结合型信息沉默调节因子1(silent mating type information regulation homolog-1，SIRT1)启动区，形成一个转录抑制复合物来抑制SIRT1的转录。

C端包含一组四个保守的C2H2锌指键。这个区域能够结合特定的DNA序列HiRE和上游远端的锌指结构。被典型的7～8个氨基酸保守H/C环分离后的锌指键可能与DNA特异序列绑定有关。

中央区是HIC1的第二个自发转录抑制区，从人到斑马鱼共包含4个完全保守的缩氨酸基序[5]。其中的一个序列GLDLSKK在蛋白中可与联合抑制物CtBP相互作用。这个抑制区，不管是CtBP依赖还是非依赖抑制型，均对制滴菌素A敏感。

2 HIC1后天修饰调节肿瘤生成

2.1HIC1启动子高甲基化 肿瘤的发生和发展被基因和后天因素调节。后天机制可以改变基因表达，但不能改变DNA原始序列，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码微RNA(microRNA，miRNA)等改变。后天过程的破坏可导致基因功能的改变和恶性的细胞转化。实际上，普遍认为异常的后天修饰是肿瘤发展的主要因素[6]。

普遍的观点是：HIC1是肿瘤抑制因子，在许多原发肿瘤和血液肿瘤中HIC1基因表达沉默，如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌、食管癌、小儿髓母细胞瘤[7-8]、神经胶质瘤、室管膜瘤[9]。应用HIC1探针、甲基化特异性聚合酶链反应和亚硫酸氢盐测序后发现，在多数人类肿瘤和白血病中，HIC1多数高甲基化。HIC1启动区的高甲基化导致HIC1基因表达沉默，在肿瘤发展过程中HIC1表达水平全部降低。 然而，在正常小儿脑组织、成人脑组织[10]和前列腺上皮细胞也可发现HIC1启动子的高甲基化。而且，在急性白血病中HIC1甲基化极少(10%)，而在慢性髓性白血病中则为50%[11-12]。但是，在所有的急性淋巴细胞白血病和慢性髓性白血病的原始细胞危象中均可见HIC1甲基化。因此，HIC1高甲基化被认为是造血组织肿瘤的晚期表象，且可能存在其他抑制HIC1表达的机制。

2.2HIC1转录靶点 HIC1的一个重要的转录靶点是SIRT1脱乙酰酶。SIRT1能够通过脱乙酰作用激活p53从而减弱其激活下游靶点，包括调节凋亡和增殖的作用。有报道称,在正常生理条件下HIC1抑制SIRT1转录从而抑制p53的脱乙酰化，但在肿瘤细胞中HIC1由于后天修饰失活，SIRT1表达水平升高[13]。这就导致脱乙酰化和p53活性降低，细胞因此停止凋亡。此外，PRE(p53效应元件)被证实存在于HIC1启动子区域，说明HIC1是p53直接靶基因[14]，而且p53可以不依赖其甲基化水平直接激活HIC1转录。因此，HIC1/SIRT1/p53调节环是一个基本通路，HIC1通过这个通路和p53协同，发挥肿瘤抑制因子的作用[15]。

Briones等[16]发现HIC1的核结合序列是GGCA，而且这个序列存在于成纤维细胞生长因子结合蛋白(fibroblast growth factor-binding protein1,FGF-BP1)启动子区域，定位于-785～-782 bp(GGCA)。Briones等[16]同时指出，转化生长因子β调节的FGF-BP1启动区HIC1核结合位点的突变可以显著影响其转录抑制作用。转化生长因子β是生长因子家族中的经典成员，在正常的血管发生及多种人类疾病中起重要作用，表明HIC1通过转化生长因子β的调节转录抑制FGF-BP1，从而影响肿瘤的血管生成。也就是失活肿瘤细胞中的HIC1可以增加FGF-BP1的表达，从而引起肿瘤血管生成和增殖的增加。

Zhang等[17]发现，HIC1可以直接调节ephrin-A1基因的一个转录抑制子，结果显示小鼠胚胎缺失HIC1等位基因和错误表达ephrin-A1都可引起发育异常。过表达ephrin-A1是HIC1杂合子引发肿瘤的一个重要特点。恢复乳腺癌中HIC1的功能可以导致体内肿瘤生长减慢，而过表达ephrin-A1可以拮抗这种作用。由此可以得出结论，肿瘤细胞中沉默的HIC1可以导致ephrin-A1的表达上调，从而引起体内肿留的生长。在高度恶性MDA-MB-231乳腺癌细胞系中HIC1的异位表达显著抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭。通过RNA调节失活正常乳腺上皮细胞中的HIC1，可以引起ephrin-A2的表达上调和细胞迁移的增加。因此，通过HIC1沉默引起的Eph通路失调节可能是上皮瘤发病的一个重要机制[18]。

Briggs等[19]发现，HIC1是细胞周期和凋亡调节因子E2F1的一个新的转录靶点。在包含HIC1 P0启动子的TATA-box中，E2F1通过两个E2F DNA结合位点影响HIC1。1在体内，E2F1和HIC1启动子区结合，诱导内源性HIC1 mRNA表达。而且，即使HIC1 P0启动子高甲基化，HIC1表达仍受E2F1调节。这一发现表明在E2F1和HIC1之间存在一个调节环。有可能内源性E2F1蛋白直接结合HIC1 P0启动子，从而激活HIC1表达；反之，HIC1结合包含HIC1结合序列位点的E2F1启动子基因，从而抑制E2F1转录减少细胞生长。

有报道称，HIC1可以直接作用于T细胞特异转录因子4(transcription of cell factor 4，TCF4)[20]。TCF4和β联蛋白相互作用激活Wnt信号，在正常发育中这个激活很重要，而它的异常调节在肿瘤发生中起重要作用。这可能抑制肿瘤的形成，因为TCF4和β联蛋白可以阻止激活肿瘤发育过程中相关的TCF效应基因，包括c-myc或细胞中期蛋白D1。

通过启动子荧光素酶激活、ChIP和序列ChIP试验，β-2肾上腺素能受体(adrenergic receptors β-2,ADRB2)被证实是HIC1的直接靶基因。ADRB2编码一个可以被肾上腺素/去甲肾上腺素激活的G蛋白偶联受体[21]。在正常肺胚胎成纤维细胞WI(wistsar institute)-38中，通过反转录病毒感染过表达HIC1可以引起ADRB2 mRNA的显著减少和蛋白水平的轻微下降。相反，通过小干扰RNA抑制WI-38细胞中HIC1表达可以引起ADRB2转录和蛋白水平的升高。在恶性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，ADRB2高表达，HIC1过表达可以明显抑制ADRB2表达和阻止其促进迁移及侵袭的作用，表明肿瘤形成时通过HIC1的沉默上调ADRB2的表达，从而促进乳腺上皮细胞的转移。

2.3肿瘤干细胞的标志物 很多研究注重于后天标记在干细胞鉴定中的作用。在胚胎干细胞中，一些发育转录因子的启动子处于“二价状态”，激活(H3K9Ac和H3K4me)和抑制(H3K27me)。因此，这些启动子处于一种转录准备的“平衡”状态，根据发育的需要，可以被激活为组织特异性基因或抑制其他发育通路的基因。实际上，在分化的细胞中，许多非转录基因的启动子没有激活标志，并且被多梳抑制复合物2沉积的H3K27三甲基化标志物所浓缩。在胚胎干细胞中的研究证实，一些肿瘤抑制基因在结肠癌、乳腺癌和卵巢癌中均有三甲基化的H3K27和其他多梳抑制复合物2预标记[22-23]。

HIC1被定义为“干细胞基因”，这是因为其可以被同源物种抑制因子12、雌激素样物质和组蛋白H3赖氨酸4三甲基化中的至少两个所标记，这三个基因存在于人类结直肠癌、卵巢癌中的胚胎干细胞细胞和CD34阳性造血祖细胞中[23]。但是在乳腺癌中除外，这可能是由于正常乳腺上皮细胞的半甲基化。另外，HIC1在人类胚胎干细胞细胞中不甲基化，而在胚胎癌性细胞系Tera-1和Tera-2中分别部分和全部甲基化[24]。

3 肿瘤微环境调节HIC1表达

3.1特异基因的DNA甲基化构成肿瘤微环境 研究发现，DNA甲基化遗传于体细胞分裂，并且CpG岛启动子的甲基化可以沉默其下游基因[24]。改变肿瘤细胞的甲基化可以导致肿瘤抑制基因和其他基因的失活。很多研究揭示，异常甲基化甚至存在于非癌性组织，但是其等级和癌变率相关，如量化甲基化可以发现异常甲基化比突变更常见[25]，并且已经证实甲基化改变存在于上皮-间质迁移中[26-27]。甲基化改变的频繁说明它可能与间质细胞的表型改变有关，即形成肿瘤微环境[28-29]。不光是上皮细胞癌变，在间质细胞形成肿瘤微环境中，DNA甲基化也起到重要作用，说明特殊基因的DNA甲基化能够诱导显著的细胞碎片。同时也说明，改变甲基化水平能够参与形成肿瘤微环境。已经有报道在肿瘤内皮细胞中存在特殊基因的沉默导致的组蛋白修饰改变[30]。肿瘤细胞的上皮-间质迁移产生的间质细胞有可能参与形成肿瘤微环境[31]。

3.2肿瘤微环境可能调节肿瘤细胞HIC1的表达 HIC1作为抑制基因在肿瘤中并未突变，但后天调节的功能缺失可能存在于肿瘤形成阶段。Xia等[32]最近发现，前列腺素E2通过增强CpG岛甲基化沉默这些肿瘤抑制物和DNA-修复基因，从而促进肠道肿瘤的生长。Ng等[33]指出，miR-143在结直肠癌中调节DNA甲基转移酶3A。这个发现帮助人们推断肿瘤微环境中的某些因子也能通过后天性修饰调节HIC1表达。实际上，不同的肿瘤环境影响组蛋白或DNA的后天性修饰，改变转录因子到DNA序列的通路，从而影响基因表达[33-34]。此外，肿瘤微环境中的间质细胞分泌的一些炎性因子和miRNA能够增加肿瘤细胞的DNA甲基转移酶类和组蛋白脱乙酰基酶活性，因此沉默包括HIC1在内的肿瘤抑制基因和重构肿瘤细胞表型。目前，新的后天性治疗抗肿瘤药物主要是复活肿瘤抑制基因[35]。然而，鉴于它们的通用基因调节环，后天治疗应该同样关注肿瘤微环境的作用。这可能提供更多的肿瘤治疗方案。

4 小结与展望

HIC1通过结合SIRT1启动子，可以中枢转录调节一些控制细胞生长和死亡的关键基因。通过与PATCHED基因结合，HIC1能成为髓母细胞瘤Hedgehog通路抑制剂，并且能够调节干细胞中Wnt通路。实际上，在许多肿瘤和白血病中，HIC1由于高甲基化而沉默或低表达，这可能成为DNA甲基转移酶抑制剂(如地西他滨等)药物新的治疗靶点。然而，HIC1的一些问题还不明朗。首先，在靶基因DNA结合区HIC1蛋白的转录调节如何实现。其次，HIC1有大量潜在的生理学功能，但HIC1特定靶基因的数量却很少。再次，肿瘤微环境如何调节肿瘤细胞中HIC1的表达还不清楚。最后，由于发现低HIC1水平有助于肿瘤生长，可能存在除了HIC1启动子高甲基化外的其他抑制机制。总之，进一步研究HIC1的功能和其作用靶点不光可以帮助人们明确它作为肿瘤抑制基因的功能和对肿瘤微环境的研究提供新的视点，还能够对许多人类肿瘤提供新的治疗方案。

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