基因芯片技术在感染性疾病研究中的应用

赵 辉(综述)，张晓娟(审校)

(陕西理工学院体育学院，陕西 汉中 723001)

基因芯片技术是20世纪90年代初，由Schena[1]所开创的一项高新技术[1]。它将特定的寡核苷酸片段或基因片段规则有序地以极高的密度排列在片基上，与荧光标记的样本按碱基配对的原理同步杂交，应用共聚焦荧光检测系统扫描、计算机分析和统计数据，可对基因的序列或功能进行研究。芯片技术为具有高通量、微型化、精确度高和对比性强的特点，为研究感染性疾病提供了新的思路和方法。目前应用芯片技术对感染性疾病的研究主要集中在对感染性疾病快速检测和诊断、感染性疾病的耐药性研究、感染性疾病的致病机制等方面。

1 感染性疾病的检测和诊断

感染性疾病(如肝炎、结核、艾滋病等)影响人类健康和寿命，一般的细菌感染很常见，快速有效地对这些疾病作出检测和诊断有助于尽早治疗，选择合适的敏感药物。传统的检测方法依靠生化血、血清学或者是分离培养来进行。诊断的特异性不高，不能准确判断出病原体的类别和种属，检测速度较慢。现代分子生物学检测(如免疫测定和聚合酶链反应技术等)虽然可以节省部分时间，但可检测的病原体种类很少[2]。运用芯片技术检测感染性疾病的原理是以待测病原体的特征基因片段制备探针，将患者血清中的病原体DNA或RNA扩增并荧光标记，通过杂交后检测荧光来判断病原体种类，特点是样品需要量少、准确性高、检测速度快，并且可以同步检测多种病原体和多个样本。这类芯片还能对病原体进行基因分型和菌种鉴定，例如根据常见病毒特征序列设计的肝炎诊断基因芯片可以快速检测出患者是否患有肝炎，以及病毒的种类、亚型，还可以检测出耐药的情况[3-4]。朱京京等[5]针对人类免疫缺陷病毒1，gag基因区基因的相对保守区设计探针，制备了用于人类免疫缺陷病毒快速检测的基因芯片，检出符合率达到98.5%。黄迎春等[6]针对中国流行的7种性传播疾病制备了快速检测基因芯片。周琦等[7]和陶生策等[8]分别制备了用于快速检测SARS的基因芯片并已初步应用于临床。王元伦等[9]和唐雨德等[10]构建了用于检测水中微量钩体的基因芯片，最低检测浓度达到5条钩体/100 mL水。随着近年来研究的不断深入和成熟，基因芯片诊断技术已经成为临床疾病诊断的重要新内容，卫生部在2009年公布了《基因芯片技术诊断管理规范》是芯片技术用于疾病诊断更加规范科学[11]。

2 感染性疾病的耐药性研究

目前多重耐药菌的感染患者越来越多，常引起区域内的交叉感染和传播，对儿童和老人尤其具有危害，例如2010年在印度、英国、日本等国引起小规模流行的NDM-1(产Ⅰ型新德里金属β内酰胺酶泛耐药肠杆科细菌)细菌，含有新型的NDM-1酶，可使所有含有β内酰胺环的药物失效[12-14]。由于耐药菌增多，全球结核病形式急剧恶化，结核病在世界范围内呈快速上升趋势。结核分枝杆菌如果同时耐受异烟肼和利福平，结核病将会很难治疗，病死率大大增加，随着艾滋病的流行和流动人口的增长，结核疫情已不容乐观。造成耐药菌大量出现的主要原因是无指征的滥用抗生素，选择性地杀死敏感菌从而降低了对耐药菌的抑制作用。对于结核病的用药，临床上的药敏试验很难起作用，主要原因是测定时间周期长(结核菌生长缓慢，耐药菌的生长更加缓慢)、精度不高、难以在疾病早期根据耐药性制订治疗方案，而基因芯片用于快速检测耐药性，指导个体化用药具有非常重要的意义。Wilson等[15]运用基因芯片技术研究发现，肺结核杆菌中的脂肪酸合成酶Ⅱ、铁转运ATP结合蛋白C、完整的膜转运蛋白、酰基辅酶A脱氢酶、烷基过氧化氢还原酶C蛋白的基因改变和耐药性有关。Gingeras等[16]创造了利用RNA聚合酶β亚基基因的寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌的方法，并发现该基因的变异与细菌对利福平的耐药性有关。李峰等[17]应用RNA聚合酶β亚基基因的基因芯片检测该基因在结核菌株中的变异程度的方法对76株临床分离的利福平耐药株进行了检测，突变检出率为85.5%。戎奇吉等[18]运用芯片技术研究了结核分枝杆菌过氧化物酶催化酶基因突变及其与异烟肼耐药相关性，发现结核分枝杆菌过氧化物酶催化酶基因S315突变与异烟肼耐药密切相关。上海博星基因芯片研究所研发的结合杆菌耐药检测芯片以临床标本(痰液)为模板，通过多重聚合酶链反应扩增并荧光标记杂交，具有较高的特异性和快速检测的优点。

3 感染性疾病致病机制的研究

基因芯片可以整体分析病原体的所有致病因子，全面研究病原体入侵宿主，逃避防御机制，宿主体内的转移，毒力基因的表达等因素。一般可分为两个方面的研究。

3.1宿主在感染病原体后的机制 研究宿主在感染病原体后的一系列生理、病理改变及致病的分子机制，宿主的个体差异(年龄、性别等)对致病的影响。通过芯片技术筛选出宿主感染前后细胞内基因的表达变化，这些变化可能会和疾病的发病机制有一定的关系，宿主在感染病原体后发生改变的基因很多，一般的方法难以全面检测，基因芯片由于高通量的优势而被广泛运用。张怡轩[19]制备了含有4096个基因的芯片，检测了溶血素基因LA1029对人肝表达谱影响，筛选出了90个具有明显表达差异的基因(涉及肝细胞的生长、分化、代谢、信号转导等)。赵雁林等[20]研究了626个免疫相关基因在结核病患者体内的表达差异，筛选出了53个差异性表达基因，其中16个细胞增殖相关基因，14个免疫应答基因，20个信号转导有关基因，3个其他免疫相关基因，为进一步研究结核并对宿主免疫功能的影响打下了基础。

3.2病原体在致病过程中的基因调控 通过对比不同毒力的病原体之间基因表达的差异性，或研究病原体在宿主内环境诱导下发生的基因表达改变，进而筛选可能的致病基因。如发现化脓性链球菌血清型M18具有编码A型化脓性链球菌毒素和两种未知化脓性毒素同源物的基因,霍乱弧菌的霍乱毒素体内表达与体外虽然并无差异，但存在获取营养的基因表达增强[21-22]。另外，运用基因芯片技术还可以检测基因突变对病原体毒力的影响。Madsen等[23]通过模拟猪体内温度刺激猪肺炎支原体，发现该病原在热激条件下发生了明显的基因表达差异。

4 展 望

在基因芯片技术不断发展的过程中，仍有许多技术问题需要完善，如芯片实验的可重复性操作、精确定量、芯片片间数据的比较、芯片实验的标准化、杂交后芯片的保存等。芯片成本价格高昂，不利于基因芯片技术的普及。我国在多方面缺少高端技术和专利权也影响到国内应用基因芯片技术进行科学研究。与国外相比，我国在应用基因芯片技术对感染性疾病的研究中存在的问题大多是重复国外研究、缺乏创新、实验简单没有技术含量、实验过程不规范、对芯片技术过分夸大和炒作。随着基因芯片技术的不断发展和完善，更多专业科研人员的共同努力，将会有更多种类、更高技术含量的基因芯片出现，在对疾病的诊断、预防、发病机制的研究中发挥更大的作用。

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