CD4+CD25+调节性T细胞及相关活化调控因子在Graves病的研究进展

陈原邻(综述)，刘喜明(审校)

(中国中医科学院广安门医院内分泌科，北京 100053)

Graves病(Graves disease，GD)又称毒性弥漫性甲状腺肿，是一种器官特异性自身免疫性疾病，约占全部甲状腺功能亢进症(甲亢)的90%。西方国家报道GD的患病率为1.1%～1.6%，我国学者报道是1.2%，女性显著高发(女∶男=4～6∶1)，高发年龄为20～50岁[1]。GD确切的免疫学发病机制尚未明确，很多研究已经证实，发挥抑制自身免疫功能进行负向免疫调节的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)及其相关活化调控因子在自身免疫性疾病的发病过程中有着重要作用。Treg同时表达CD4和白细胞介素2受体α链(interleukin 2 receptor α，IL-2Rα，即CD25)表面抗原[2]。通过细胞接触依赖和细胞因子依赖机制参与自身免疫的抑制过程，在维持机体内环境稳定、防治自身免疫疾病、抑制移植反应、抗肿瘤免疫等方面发挥重要的调节作用。CD4+CD25+Treg细胞在特异性抗原或抗原呈递细胞刺激下不出现应答状态，自身也不分泌IL-2或者经T细胞抗原受体介导的信号刺激活化后抑制CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B细胞等免疫细胞的活化和增殖以及分泌相应的细胞因子[3]。

1 CD4+CD25+Treg细胞与GD

Saitoh等[4]研究发现，在促甲状腺激素受体腺病毒诱导产生GD的过程中，去除抵抗GD的C57BL/6小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞，GD可以自发产生，而去除易感GD的BALB/c小鼠体内的CD4+CD25+Treg细胞，甲亢加重，说明实验动物体内的CD4+CD25+Treg细胞起决定性作用。党珊等[5]研究表明，初发GD患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞水平与健康人相比显著降低，表明在GD的发病过程中由于CD4+CD25+Treg细胞数量减少，造成机体自身免疫耐受系统失调，导致GD。GD的发病机制可能不仅与Treg细胞数量有关，也与Treg细胞功能降低存在密切联系。赵湜等[6]研究表明，GD患者Treg细胞在外周血淋巴细胞中的比例无明显改变，提示Treg细胞数量可能对GD的发病不起关键作用，而是Treg细胞分泌细胞因子进行免疫调节的功能明显减弱，导致GD。唐大海等[7]的研究表明，GD患者外周血中Treg细胞的数量虽然与正常对照组无差异，但其免疫抑制功能显著降低，显示Treg细胞功能降低与GD的发病存在一定关联性。目前关于GD的Treg细胞数量变化存在争议。不同学者的研究可能存在疾病所处发展阶段不同、Treg细胞的分离标记方法存在差异、部分受试对象已经使用免疫抑制剂治疗等问题，导致研究结果并不完全一致。

2 CD4+CD25+Treg细胞的相关活化调控因子

2.1Treg细胞活性发挥的关键调控基因——Foxp3 Foxp3即叉状头/翅膀状螺旋转录因子，位于X染色体，编码产物是Scurfin蛋白。Foxp3基因特异且稳定地表达于CD4+CD25+Treg细胞亚群，是Treg细胞的一个特异性标志，对机体免疫应答进行负向调节，阻止自身免疫的产生，是CD4+CD25+Treg细胞分化和发挥免疫活性所必需的关键调节基因[8-9]。既往动物实验证实，阻断CD4+CD25+Treg细胞表达Foxp3后，表面CD25、CD45RB、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)及糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)等表达水平下调，其负向调节活性显著下降；而高水平表达Foxp3的CD4+CD25+Treg细胞也高表达CD25、CD45RB、CTLA-4及GITR，其负向调节活性亦较正常CD4+CD25+Treg细胞强。

刘荣军[10]研究发现，Foxp3基因突变或剔除的小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞数量下降，细胞调节功能缺陷，是诱发自身免疫反应的可能原因。GD患者存在CD4+CD25+Treg细胞Foxp3表达的改变。Wang等[11]研究发现，GD患者CD4+CD25+Treg细胞数量无明显改变，但Foxp3表达减少，提示Foxp3的减少削弱了GD患者外周血Treg细胞功能，这可能是GD发病的原因。钱伟等[12]研究显示，GD患者体内存在Foxp3表达异常，GD相关的T细胞所受到的免疫抑制不足，因此推测Foxp3可能参与了GD的发病。

2.2与Treg免疫活性相关的细胞表面标志物 Treg细胞膜表面分子(如CTLA-4、GITR、人类白细胞DR抗原等)可以与抗原呈递细胞表面共刺激分子接触，被激活后发挥抑制免疫活性作用。但这些膜表面分子对于CD4+CD25+Treg细胞不具有特异性，具体的接触机制还需进一步研究[13]。

2.2.1CTLA-4(CD152) CTLA-4是Treg细胞发挥抑制作用的重要的细胞膜表面分子。Treg可以通过CTLA-4与抗原呈递细胞或者活化的T细胞表面B7配体(CD80、CD86)结合，产生转导反向信号——细胞内的吲哚氨2,3-双加氧酶活化，吲哚氨2,3-双加氧酶是色氨酸代谢的必需酶，使游离色氨酸减少，从而导致T细胞的增殖和活化程度降低，抑制效应细胞功能和活性[14]。

体内试验数据表明，表达于活化T细胞的CTLA-4可提高Treg细胞的数量，产生转化生长因子β，减少γ干扰素，从而预防自身免疫性甲状腺疾病[15]。目前研究较多的CTLA-4基因多态性与GD患病风险高度相关，尤其在白种人和亚洲人[16]。

2.2.2GITR GITR又称活化诱导的肿瘤坏死因子受体，在CD4+CD25+Treg细胞上具有高水平表达，并在抗体CD3抗和IL-2刺激后，表达量进一步上调[17]。

Morris等[18]动物实验证实，GITR可以打破小鼠的免疫耐受状态，诱发自身免疫性甲状腺炎，体外实验进一步证实，表达GITR的信号增强了甲状腺活化T细胞的免疫功能，从而降低CD4+CD25+Treg细胞的抑制功能。Shimizu等[19]研究发现，在共培养的CD4+CD25T细胞和CD4+CD25+T细胞体系中加入抗GITR抗体引起GITR的触发活化，可以遏制Treg细胞的抑制作用。动物实验显示，GITR在发挥作用的过程中可能存在其他代偿免疫机制，增强GITR/GITRL接触在T细胞免疫应答中可以发挥多效性，包括促进类似Treg细胞亚群之一的Tr-1细胞分化，维持外周T细胞耐受[20]。尽管在人的Treg细胞表面也存在GITR的高水平表达，但是用抗人GITR抗体或重组人GITRL与GITR结合后，Treg细胞的抑制活性并未受到干扰。仝佳等[21]研究显示，GITR在物种间功能存在差别，GITR 可能在小鼠和人类体内发挥不同作用，此其对人Treg细胞的影响机制还需进一步研究。临床数据显示，GD患者的GITR mRNA相对表达水平明显低于经过治疗的患者和正常人，且与促甲状腺激素呈正相关，与血清游离三碘甲状腺原氨酸、血清游离甲状腺素水平均呈负相关，GD临床缓解组与健康对照组差异无统计学意义，提示GD的发生可能与GD患者体内GITR基因表达下调有关[22]。

2.2.3CD127+CD127+是IL-7Rα，可以调控T淋巴细胞对IL-7的特异性应答。研究发现，CD127+在CD4+CD25+Treg细胞中低表达，且具有特异性，表现为CD127+在效应T细胞和记忆T细胞活化后持续表达，而只在调节性T淋巴细胞表达下降[23-24]。Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞目前公认的标志。近年来的研究显示，CD127+与Foxp3的表达呈负相关，且CD127+检测相对简便，标记无需破膜，被分离提纯的细胞可用于进一步的培养研究，因此CD4+CD25+CD127+或CD4+CD25+CD127+逐渐成为CD4+CD25+Treg细胞新的筛选标记[25]。

Su等[26]通过标记、分离、增殖CD4+CD25+CD127+Treg细胞并评价其抑制功能，认为CD4+CD25+CD127+Treg细胞在维持外周耐受和控制自身免疫病的发展过程中有决定作用，其治疗干预移植排斥和自身免疫疾病具有巨大潜力。CD4+CD25+CD127Treg细胞在GD患者中显著降低，提示免疫抑制和免疫耐受功能受损可能导致GD[27]。

3 小 结

Treg细胞具有免疫抑制功能，可以负向调节T细胞免疫反应而维持自身免疫平衡，在自身免疫性疾病GD的诊断、病情评价、预后判断中具有一定的参考价值。但是，目前国内对GD的免疫学研究仍存在研究方法相对单一、缺乏系统认识的问题，临床研究较多，免疫学机制的深层研究较少；细胞因子网络、Treg细胞、GD之间的相互影响机制不够明确。因此，深入探讨Treg细胞及其相关调控因子与GD的关系和相互影响机制，有助于为GD发病机制的研究提供新的思路，并为GD的免疫学治疗提供新策略。

[1] 陆再英,钟南山.内科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:712.

[2] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,etal.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25)breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151-1164.

[3] Lim HW,Hillsamer P,Banham AH,etal.Cutting edge:direct suppression of B cells by CD4CD25T cells[J].J Immunol,2005,175(7):4180-4183.

[4] Saitoh O,Nagayama Y.Regulation of Graves′ hyperthyroidism with naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells in a mouse mode1[J].Endocrinology,2006,147(5):2417-2422.

[5] 党珊,施秉银.Graves病患者CD4+CD25+调节性T细胞的变化[J].中华内分泌代谢杂志,2007,23(3):253-254.

[6] 赵湜,王红祥,毛红,等.Graves病中调节性T细胞功能的改变[J].中国医师进修杂志,2009,29(10):37-39.

[7] 唐大海,徐尔理,吴玲.Graves病患者外周血CD4、CD25调节性T细胞的定量及功能分析[J].海军医学杂志,2008,29(2):114-118.

[8] Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription facor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061.

[9] Roncador G,Brown PJ,Maestre L,etal.Analysis of FOXP3 protein expression in human CD4+CD25+regulatory T cells at the single cell level[J].Eur J Immunol,2005,35(6):1681-1691.

[10] 刘荣军.转录因子Foxp3在免疫调节中的作用[J].现代免疫学,2005,25(1):75-77.

[11] Wang H,Zhao S,Tang X,etal.Changes of regulatory T cells in Graves′disease[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006,26(5):545-547.

[12] 钱伟,张强,吴汉妮,等.Foxp3在Graves病患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义[J].中国免疫学杂志,2010,27(1):76-78.

[13] Shevach EM.Regulatory/suppressor T cells in health and disease[J].Arthritis Rheum,2004,50(9):2721-2724.

[14] Birebent B,Lorho R,Lechartier H,etal.Suppressive properties of human CD4+CD25+regulatory T cells are dependent on CTLA-4 expression[J].Eur J Immunol,2004,34(12):3485-3496.

[15] Vasu C,Gorla SR,Prabhakar BS,etal.Targeted engagemenl of CTLA-4 prevents autoimmune thyroiditis[J].Int Immunol,2003,15(5):641-654.

[16] Si X,Zhang X,Tang W,Luo Y.Association between the CTLA-4 +49A/G polymorphism and Graves′ disease:A meta-analysis[J].Exp Ther Med,2012,4(3):538-544.

[17] McHugh RS,Whitters MJ,Piccirillo CA,etal.CD4+CD25+immunoregulatory T cells:gene expression analysis reveals a fanctional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor[J].Immunity,2002,16(2):311-323.

[18] Morris GP,Kong YC.Interference with CD4+CD25+T-cell-mediated tolerance to experimental autoimmune thyroiditis by glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor monoclonal antibody[J].J Autoimmun,2006,26(1):24-31.

[19] Shimizu J,Yamazaki S,Takahashi T,etal.Stimulation of CD25+CD4+regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance[J].Nat Immunol,2002,3(2):135-142.

[20] Carrier Y,Whitters MJ,Miyashiro JS,etal.Enhanced GITR/GITRL interactions augment IL-27 expression and induce IL-10-producing Tr-1 like cells[J].Eur J Immunol,2012,42(6):1393-1404.

[21] 仝佳,王胜军,毛朝明,等.人GITR基因的克隆和序列分析[J].江苏大学学报:医学版，2007,17(1):15-18.

[22] 王海生,王胜军,崔大伟,等.Graves病患者外周血单个核细胞GITR mRNA表达水平的变化和意义[J].临床检验杂志,2009,27(4):276-279.

[23] Baecher-Allan C,Viglietta V,Hafler DA,etal.Human CD4+CD25+regulatory T cells[J].Semin Immunol,2004,16(2):89-98.

[24] Seddiki N,Santner-Nanan B,Martinson J,etal.Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1693-1700.

[25] Liu W,Putnam AL,Xu-YU Z,etal.CD127+expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+T reg cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1701-1711.

[26] Su H,Longhi MS,Wang P,etal.Human CD4+CD25(high)CD127+(low/neg) regulatory T cells[J].Methods Mol Biol,2012,806:287-299.

[27] 董经纬.Graves病患者CD4+CD25+CD127+-调节性T细胞的变化[D].南宁:广西医科大学，2010.