Snapin在神经细胞中的功能及其在神经疾病中的研究进展

程国强(综述)，张传领，肖 瑞(审校)

(内蒙古医科大学 1分子病理学重点实验室， 2药学院，呼和浩特 010059)

Snapin蛋白又称突触小体相关蛋白(synaptosome-associated protein，SNAP)，其在神经细胞内与SNAP-25结合，促进Ca2+感受蛋白与可溶性NSF附着蛋白受体(soluble NSF attachment protein receptors，SNARE)复合体结合[1]，从而调控囊泡膜融合及神经递质释放。SNARE复合体是神经突触中介导囊泡融合的核心蛋白，同时也参与了神经元的伸展过程。研究发现，Snapin蛋白缺失可导致神经元生存能力降低、退化及中枢神经系统发育缺陷[2]。

1 Snapin蛋白的结构和表达

Snapin蛋白在神经、生殖、肌肉、内分泌及血液等系统中均有表达，其在神经元细胞中的表达最为丰富，主要分布于突触囊泡膜上[1]。Snapin蛋白相对分子质量约为15×103，由136个氨基酸组成[3]；其二级结构大部分为α螺旋，N端有一个疏水区，C端有一个由2个螺旋区H1和H2形成的卷曲螺旋，该螺旋结构域在许多囊泡融合蛋白中保守存在。Snapin蛋白主要通过卷曲螺旋与其他蛋白作用而发挥功能[3]。

2 Snapin在神经细胞中相互作用的蛋白及功能

Snapin蛋白是SNARE复合物的重要调节蛋白，在神经递质释放过程中发挥着重要作用，其同时还与雌激素受体结合位点相关抗原9(estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9，EBAG9)[4]、cytosolic PSD-95 interactor(cypin)[5]、酪蛋白激酶1δ[6-7]、胞外分泌复合体关键亚基[8]、经典瞬时受体电位6[9]、膜转运调控蛋白1[10]、dystrobrevin-binding protein-1(dysbindin-1)[11]、腺苷酸环化酶Ⅵ(adenylate cyclase Ⅵ，AC6)[12]、鱼尼丁受体[13]、尿素通道蛋白A1[14]等蛋白相互作用，其中多数蛋白在囊泡运输中发挥作用。另外，Snapin蛋在非神经细胞中同样也具有重要作用。

2.1与SNAP-25的相互作用 神经突触间递质的释放是神经系统最重要的生物现象之一，其受到精确调控。囊泡被招募、锚靠后，还需预激，从而引起突触囊泡发生胞吐。SNARE蛋白根据其分布的位置分为t-SNARE和v-SNARE。t-SNARE分布于靶膜上，包括突触融合蛋白和SNAP-25家族；v-SNARE分布于囊泡膜上，称为囊泡相关膜蛋白或突触泡蛋白。SNARE复合物拉近突触小泡与突触前膜的距离，促使两者融合并释放神经递质。以Ca2+内流为诱导，Ca2+与细胞内部的Ca2+感受器(如突触结合蛋白Ⅰ)结合来协同控制囊泡胞吐释放。

Snapin蛋白在调节神经递质释放中发挥着重要作用。体外蛋白结合实验显示，Snapin蛋白通过与SNAP-25直接结合而与脑内SNARE复合物作用。加入外源性重组Snapin蛋白可促进突触结合蛋白Ⅰ与SNARE复合物的结合，尤其当Snapin经蛋白激酶A磷酸化后，这一现象更加明显[15]。当Snapin蛋白缺失后，小鼠脑匀浆中的突触结合蛋白Ⅰ与SNAP-25的结合量显著减少[16]。潘平越等[17]采用双膜片钳全细胞记录技术发现，Snapin蛋白在调节突触囊泡快速同步融合中发挥着独特的作用。Snapin除了参与调节Ca2+依赖的胞吐活动外，也可调节其他SNARE复合体介导的囊泡融合事件。

2.2与瞬时受体电位相互作用 瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道是一类广泛分布在神经系统细胞膜上的非选择性阳离子通道，瞬时受体电位通道7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)是在神经递质囊泡上发现的第1个TRP通道。Krapivinsky等[18]研究发现，TRPM7与Snapin蛋白共存于神经递质囊泡上，与突触结合蛋白Ⅰ、突触蛋白一起形成蛋白复合物。TRPM7本身对突触传递有调节作用。TRPM7与Snapin的相互作用也影响了突触传递：将干扰Snapin蛋白与TRPM7相互作用的肽段注射至突触前神经元后发现突触后电压降低[18]。然而，TRPM7不是唯一与Snapin有相互作用的TRP成员。Morenilla-Palao等[19]的研究发现，TRP香草酸亚型1通道可与Snapin、突触结合蛋白Ⅸ结合，抑制由蛋白激酶C介导的TRP香草酸亚型1通道向细胞膜的募集过程，减小放大效应。Snapin通过与 TRP通道结合调控细胞内囊泡转运、融合的过程。

2.3与EBAG9相互作用 在非神经细胞中，EBAG9的产物是肿瘤相关的O-连接糖基化调节蛋白[20]。在神经细胞中，Rüder等[4]发现，EBAG9能与Snapin相互作用，调节与突触结合蛋白相关的胞吐作用。EBAG9在肾上腺嗜铬细胞瘤细胞中的表达能抑制细胞内Snapin的磷酸化，通过降低Snapin与SNAP-25的结合而减少致密核心大囊泡的胞吐活动[10]。

2.4与LRRK2相互作用 Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)基因又名PARK8，该基因突变可引起常染色体显性家族性帕金森病[21]。LRRK2基因编码2527个氨基酸，包括有活性的鸟苷三磷酸酶功能性激酶结构域以及介导蛋白间相互作用的结构域leucine-rich repeat和WD40。LRRK2的过量表达会引起胞内蛋白聚集、神经突触缩短、神经元分支数目减少以及氧化应激引起的神经毒性增强[22-23]。研究发现，LRRK2通过与Snapin结合而抑制其磷酸化，减少Snapin与SNAP-25的结合，从而调控神经递质的释放[21,24]。

2.5与DTNBP1相互作用 DTNBP1作为精神分裂症的易患基因之一，通常与认知障碍等临床症状相关[25]。研究发现，DTNBP1编码的蛋白dysbindin在精神分裂症患者脑组织中低表达[24]。Talbot等[11]发现，dysbindin能与Snapin蛋白直接结合，共存于突触前神经递质的囊泡膜上。研究发现，Sandy小鼠(DTNBP1缺失的自发突变小鼠)海马神经元的神经分泌功能与神经突触形态都出现异常，同时Sandy小鼠也出现精神分裂症的表型，例如社会性退缩和认知功能障碍。在Sandy小鼠的海马中，DTNBP1的缺失可导致Snapin蛋白的表达降低[26]。在大脑认知功能关键区域表达的dysbindin在精神分裂症患者的大脑海马及前皮质处的表达均下降[26]。体外培养的皮质神经元内的dysbindin蛋白表达降低，可导致兴奋性神经递质谷氨酸减少及谷氨酸性神经突触传递减弱[27]。海马与皮质功能区谷氨酸突触传递减弱可能是精神分裂症的病理机制之一[28-29]。Snapin通过调节突触前SNARE复合物的形成状态而影响突触传递的强度，dysbindin可能通过与Snapin蛋白结合参与调控神经递质的释放，从而影响谷氨酸能神经元的突触信息传递。

2.6在自噬及溶酶体降解途径中的作用 在神经元的维护和生存方面，自噬及溶酶体降解途径发挥着重要的作用。Snapin作为动力蛋白的运动连接蛋白，协调反向运输和晚期内涵体-溶酶体运输，从而维持神经元内有效的自噬-溶酶体降解功能[30]。Snapin(-/-)剔除后的神经元逆运输受损、内涵体沿神经末梢聚集、不成熟溶酶体反常聚集、自噬泡清理受损[31]，而将Snapin重新导入细胞内可恢复这些受损的表型特征[32]，因此研究者认为，Snapin可能是自噬-溶酶体调控途径的分子靶标[7]。Snapin蛋白缺失可导致中枢神经系统发育缺陷[33]。Snapin剔除后可导致溶酶体的蛋白水解酶组织蛋白酶D活性形式减少和功能降低，导致溶酶体不具备有效的消化功能[2]。进而导致神经元内自噬体明显增多，这与儿童遗传性进行性神经系统变性疾病Batten 病的病理特征相似[34]，因此推测Sanpin可能与溶酶体功能缺陷的神经系统疾病的发生密切相关。

2.7与AC6、cypin、dynein的相互作用 环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一种重要的调节神经元生长的第二信使，而AC6是催化cAMP合成的关键酶。研究发现，AC6的N端与Snapin蛋白直接作用，调控神经突触的生长[35]。Snapin蛋白与AC6的相互作用能够减弱蛋白激酶C对AC6的抑制，从而调节脑内cAMP的合成[12]。猜测AC6与Snapin的相互作用可使SNARE复合物的结构重新分布，从而影响神经突触的生长。

Cypin是一个能够调节神经树突数量的蛋白，包含锌结合位点、塌陷反应介导蛋白(collapsin response mediator protein，CRMP)同源结构域、PSD-95,discs large,zona occludens-1结合区等结构域，其中锌结合位点和CRMP同源结构域是树突分化所必需的。Cypin通过CRMP同源结构域与微管蛋白结合促进微管组装，促进树突形成[36]。Snapin也可与cypin的CRMP同源结构域结合，从而与微管蛋白竞争与cypin的结合，进而减缓了微管的组装，减少树突的形成数量[5]。

相关研究表明，Snapin蛋白可与dynein相互作用，从而调控皮质神经元树突的生长[31-32]。Snapin敲除或者阻止两者的相互作用，酪氨酸激酶受体B的向后运输消失，同时脑源性神经受体因子诱导的轴突末梢信号向细胞核的运输受损，导致树突生长受到抑制。重新导入Snapin蛋白后，这些影响又可恢复[33]。综上所述，Snapin可以与多种因子相互作用，通过不同机制调控神经元的生长。

3 小 结

Snapin蛋白作为SNARE复合物的调控蛋白在神经递质释放过程中发挥着重要作用。随着实验技术的发展和研究内容的丰富，人们对Snapin蛋白有了新的认识。Snapin在神经和非神经细胞中都有表达，能与多种蛋白质相互作用，在很多生物生理学过程中发挥重要作用。通过了解在神经细胞中与Snapin蛋白相互作用的蛋白，并探讨其在神经生长及相关神经疾病中的作用，可为神经系统病变的诊断和治疗提供理论依据和指导意见。

[1] Ilardi JM,Mochida S,Sheng ZH.Snapin:a SNARE-associated protein implicated in synaptic transmission[J].Nat Neurosci,1999,2(2):119-124.

[2] Cai Q,Sheng ZH.Uncovering the role of Snapin in regulating autophagy-lysosomal function[J].Autophagy,2011,7(4):445-447.

[3] Gowthaman R,Silvester AJ,Saranya K,etal.Modeling of the potential coiled-coil structure of snapin protein and its interaction with SNARE complex[J].Bioinformation,2006,1(7):269-275.

[4] Rüder C,Höpken UE,Wolf J,etal.The tumor-associated antigen EBAG9 negatively regulates the cytolytic capacity of mouse CD8+T cells[J].J Clin Invest,2009,119(8):2184-2203.

[5] Chen M,Lucas KG,Akum BF,etal.A novel role for snapin in dendrite patterning:interaction with cypin[J].Mol Biol Cell,2005,16(11):5103-5114.

[6] Bischof J,Randoll SJ,Süßner N,etal.CK1δ Kinase Activity Is Modulated by Chk1-Mediated Phosphorylation[J].PLoS One,2013,8(7):e68803.

[7] Starcevic M,Dell′Angelica EC.Identification of snapin and three novel proteins (BLOS1,BLOS2,and BLOS3/reduced pigmentation) as subunits of biogenesis of lysosome-related organelles complex-1 (BLOC-1)[J].J Biol Chem,2004,279(27):28393-28401.

[8] Bao Y,Lopez JA,James DE,etal.Snapin interacts with the Exo70 subunit of the exocyst and modulates GLUT4 trafficking[J].J Biol Chem,2008,283(1):324-331.

[9] Suzuki F,Morishima S,Tanaka T,etal.Snapin,a new regulator of receptor signaling,augments α1A-adrenoceptor-operated calcium influx through TRPC6[J].J Biol Chem,2007,282(40):29563-29573.

[10] Wei S,Xu Y,Shi H,etal.EHD1 is a synaptic protein that modulates exocytosis through binding to snapin[J].Mol Cell Neurosci,2010,45(4):418-429.

[11] Talbot K,Louneva N,Cohen JW,etal.Synaptic dysbindin-1 reductions in schizophrenia occur in an isoform-specific manner indicating their subsynaptic location[J].PLoS One,2011,6(3):e16886.

[12] Wu CS,Lin JT,Chien CL,etal.Type Ⅵ Adenylyl Cyclase Regulates Neurite Extension by Binding to Snapin and Snap25[J].Mol Cell Biol,2011,31(24):4874-4886.

[13] Kinoshita SM,Kogure A,Taguchi S,etal.Snapin,Positive Regulator of Stimulation-Induced Ca2+Release through RyR,Is Necessary for HIV-1 Replication in T Cells[J].PLoS One,2013,8(10):e75297.

[14] Mistry AC,Mallick R,Klein JD,etal.Functional characterization of the central hydrophilic linker region of the urea transporter UT-A1:cAMP activation and snapin binding[J].Am J Physiol Cell Physiol,2010,298(6):C1431-C1437.

[15] Navarro A,Encinar JA,Loópez-Meéndez B,etal.Mutation of Ser-50 and Cys-66 in snapin modulates protein structure and stability[J].Biochemistry,2012,51(16):3470-3484.

[16] Tian JH,Wu ZX,Unzicker M,etal.The role of Snapin in neurosecretion:snapin knock-out mice exhibit impaired calcium-dependent exocytosis of large dense-core vesicles in chromaffin cells[J].J Neurosci,2005,25(45):10546-10555.

[17] 潘平越,陆佩华,盛祖杭.神经元突触前可塑性的结构及分子基础[J].生物化学与生物物理进展,2004,31(7):584-589.

[18] Krapivinsky G,Mochida S,Krapivinsky L,etal.The TRPM7 ion channel functions in cholinergic synaptic vesicles and affects transmitter release[J].Neuron,2006,52(3):485-496.

[19] Morenilla-Palao C,Planells-Cases R,García-Sanz N,etal.Regulated exocytosis contributes to protein kinase C potentiation of vanilloid receptor activity[J].J Biol Chem,2004,279(24):25665-25672.

[20] Wolf J,Reimer TA,Schuck S,etal.Role of EBAG9 protein in coat protein complex I-dependent glycoprotein maturation and secretion processes in tumor cells[J].FASEB J,2010,24(10):4000-4019.

[21] Yun H J,Park J,Ho D H,etal.LRRK2 phosphorylates Snapin and inhibits interaction of Snapin with SNAP-25[J].Exp Mol Med,2013,45(8):e36.

[22] Zimprich A,Biskup S,Leitner P,etal.Mutations in LRRK2 Cause Autosomal-Dominant Parkinsonism with Pleomorphic Pathology[J].Neuron,2004,44(4):601-607.

[23] Chai C,Lim KL.Genetic Insights into Sporadic Parkinson′s Disease Pathogenesis[J].Curr Genomics,2013,14(8):486-501.

[24] Long P,Samnakay P,Jenner P,etal.A yeast two-hybrid screen reveals that osteopontin associates with MAP1A and MAP1B in addition to other proteins linked to microtubule stability,apoptosis and protein degradation in the human brain[J].Eur J Neurosci,2012,36(6):2733-2742.

[25] Norton N,Williams HJ,Owen MJ.An update on the genetics of schizophrenia[J].Curr Opin Psychiatry,2006,19(2):158-164.

[26] Weickert CS,Straub RE,McClintock BW,etal.Human dysbindin (DTNBP1) gene expression in normal brain and in schizophrenic prefrontal cortex and midbrain[J].Arch Gen Psychiatry,2004,61(6):544-555.

[27] Numakawa T,Yagasaki Y,Ishimoto T,etal.Evidence of novel neuronal functions of dysbindin,a susceptibility gene for schizophrenia[J].Hum Mol Genet,2004,13(21):2699-2708.

[28] Tsai G,Coyle JT.Glutamatergic mechanisms in schizophrenia[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2002,42(1):165-179.

[29] Behrendt RP.Dysregulation of thalamic sensory ′transmission′ in schizophrenia:neurochemical vulnerability to hallucinations[J].J Psychopharmacol,2006,20(3):356-372.

[30] Yuzaki M.Snapin snaps into the dynein complex for late endosome-lysosome trafficking and autophagy[J].Neuron,2010,68(1):4-6.

[31] Cai Q,Lu L,Tian JH,etal.Snapin-regulated late endosomal transport is critical for efficient autophagy-lysosomal function in neurons[J].Neuron,2010,68(1):73-86.

[32] Zhou B,Cai Q,Xie Y,etal.Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons[J].Cell Rep,2012,2(1):42-51.

[33] Zhou B,Zhu YB,Lin L,etal.Snapin deficiency is associated with developmental defects of the central nervous system[J].Biosci Rep,2011,31(2):151-158.

[34] Siintola E,Lehesjoki AE,Mole SE.Molecular genetics of the NCLs-status and perspectives[J].Biochim Biophys Acta,2006,1762(10):857-864.

[35] Wang SC,Lin JT,Chern Y.Novel regulation of adenylyl cyclases by direct protein-protein interactions:insights from snapin and ric8a[J].Neurosignals,2009,17(3):169-180.

[36] Kwon M,Fernández JR,Zegarek GF,etal.BDNF-promoted increases in proximal dendrites occur via CREB-dependent transcriptional regulation of cypin[J].J Neurosci,2011,31(26):9735-9745.