早期糖尿病肾病新生物标志物的研究进展

张文涛(综述),李社莉(审校)

(延安大学附属医院内分泌科，陕西 延安 716000)

糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，在过去的30年里,糖尿病患者的数量翻了一倍,已成为全球所有国家最重要的公共卫生挑战之一[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重和最常见的慢性微血管并发症，是导致终末期肾病的最主要病因。目前DN复杂的发病机制和病理生理特点还没有得到很好的理解。DN是否会发生，何种类型肾脏相关的临床事件将会发生，以及DN如何发展，肾病如何恰当地临床分期和判断疗效情况，都需要合适的生物标志物。最近,特别是在人类基因组计划的完成,蛋白质组学(系统分析蛋白质的身份、数量和功能)应用于DN的研究,使糖尿病相关生物标志物的研究出现飞速发展[2]。

1 肾小球功能障碍生物标志物

1.1铁传递蛋白 铁传递蛋白(transferrin，Tf)是肝脏合成的糖蛋白,正常情况下Tf不能通过肾小球滤过膜。早期肾损伤时肾小球基膜内外负电荷位点明显减少,使循环中带负电荷的分子蛋白Tf自肾小球滤过膜滤过出现在尿液中，主要反映肾小球滤过膜电荷选择屏障受损。

Gonzalez等[3]采用免疫组织化学和免疫电镜研究发现，Tf在糖尿病患者的肾小球足细胞的细胞质和肾小球囊细胞沉积，导致DN的发生。Kanauchi等[4]据尿微量白蛋白排泄的速率，将60例2型糖尿病患者分成正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和临床蛋白尿组，38例非糖尿病志愿者作为健康对照组。采用乳胶-免疫-比浊法对24 h的尿液标本进行检测，结果显示：微量转铁蛋白的发病率在正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组、临床蛋白尿组分别为33.3%、63.2%和18.2%，明显尿转铁蛋白的发病率分别为0、36.8%和81.8%。相对于非糖尿病对照组，2型糖尿病患者尿液Tf显著增加，在2型糖尿病患者中，随着肾小球弥漫性病变的进展,尿液中的Tf显著增加，提示尿液Tf在检测DN的早期阶段可能是有用的。

1.2Ⅳ型胶原 Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)是构成肾小球基膜及肾小球膜基质的主要成分。Ⅳ-C穿透基膜在细胞外基质形成胶原纤维网构成基膜的主要框架，通过结合上面的细胞粘连分子发挥选择性屏障作用。肾小球硬化发生纤维化时使Ⅳ-C合成增加，代谢减慢，积聚在基膜。DN患者的基膜增厚主要与Ⅳ-C代谢异常有关，随糖尿病病程的延长其水平呈递增趋势，并与血糖控制水平有关。

Inoue等[5]通过酶免疫测定法检测2型糖尿病患者尿液Ⅳ-C水平，结果显示，2型糖尿病患者的Ⅳ-C水平随肾病的发展而增加，即使在正常白蛋白尿时也明显增加，提示Ⅳ-C水平的增高可能反映了细胞基膜或基质的结构在尚未出现微量白蛋白尿时已发生改变，研究结果提示,在2型糖尿病患者中检测尿液Ⅳ-C对于发现早期阶段DN有一定作用。Tan 等[6]使用夹心亲和素-生物素复合法直接测量Ⅳ-C排泄率，研究表明有微量蛋白尿和大量蛋白尿的糖尿病患者其Ⅳ-C的排泄率均显著高于非糖尿病患者，且Ⅳ-C随着肾病等级的提高其排泄率逐渐增加。在正常白蛋白尿的2型糖尿病患者中Ⅳ-C 的排泄也是增加的。对胶原蛋白排泄升高的肾小球进行肾活检表现出典型的DN的病理改变。研究结果提示，Ⅳ-C可能是早期DN的临床有用的指标。Cohen等[7]的研究发现，尿液Ⅳ-C与糖尿病患者的排泄和肌酐清除率呈负相关，尿液Ⅳ-C较高的患者肾功能逐渐恶化，提示尿液Ⅳ-C可作为监视肾功能发展的指标。

2 肾小管功能障碍标志物

2.1中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是脂质运载蛋白家族的新成员，最先在人中性粒细胞中被发现，在前列腺和肾近曲小管细胞内水平最高，分子量较大，正常肾小球不能滤过，尿路中的NAGL主要来源于肾近曲小管的上皮细胞。研究表明，当机体受到有害的诱导，NGAL的表达就会大幅度增加[8]。

Yang等[9]对72例2型糖尿病患者随访研究发现，从正常蛋白尿组到临床蛋白尿组，尿液中NGAL呈递增趋势。此外，尿液中NGAL与肾小球滤过率呈负相关，提示NGAL与肾功能密切相关，尿液中NGAL适用于DN的早期检测和预测2型糖尿病肾病的进展。Bolignano等[10]对56例2型糖尿病患者的研究表明，2型糖尿病患者在没有肾小球损害的早期征兆时(即没有蛋白尿时)已有NGAL的增加，且其数值的增加与DN患者肾脏疾病的严重程度呈正相关，且与血肌酐、尿蛋白呈正相关，与肾小球滤过率呈负相关，提示NGAL测量可能成为一个有用的早期诊断早期肾病的标志物。Nielsen等[11]对1型糖尿病患者进行随机干预随访研究显示，NGAL的初期增高表明肾小管损坏处于初级阶段，且与终末期肾病和死亡相关。

2.2尿上皮钙黏着蛋白 尿上皮钙黏着蛋白是一种维持血管内皮细胞极性和完整性必不可少的钙黏着蛋白,是血管内皮细胞黏附连接的主要黏附蛋白，也是内皮细胞所特有的钙黏着蛋白[12]。钙黏着蛋白是一组介导同型细胞黏附连接的钙依赖性Ⅰ型跨膜糖蛋白，正常肾组织中表达丰富，主要集中于肾小管上皮细胞的细胞膜及细胞互相接触的间隙中。目前的研究表明，在炎症情况下血管内皮细胞分泌一氧化氮、内皮素等自体活性物质，作用于血管内皮细胞钙黏着蛋白的复合体致血管通透性增高，因此研究检测可溶性钙黏着蛋白水平可间接推断是否存在血管内皮细胞损伤[13]。但随着DN进展尿液中钙黏着蛋白水平下降，而血清中的钙黏着蛋白水平在2型糖尿病患者中比健康人显著增高，提示糖尿病患者存在血管内皮细胞的损伤[14]。

Jiang等[15]基于荧光差异凝胶电泳和质谱分析方法检测以确定尿液样本中新的生物标志物，与对照组相比，尿液上皮钙黏着蛋白在糖尿病组、DN1组和DN2组中其分别上调1.3倍、5.2倍和8.5倍。与DM组和对照组相比，DN1组和DN2组尿液上皮钙黏着蛋白与肌酐比值显著增加。尿液上皮钙黏着蛋白诊断DN的灵敏度和特异度分别为78.8%(95%CI74～83)和80%(95%CI65～91)。此外，免疫组织化学染色显示，与对照组相比，DN患者的肾小管上皮细胞上皮钙黏着蛋白的表达显著下降。研究结果提示，上皮钙黏着蛋白可能参与DN的发病机制，尿液上皮钙黏着蛋白在糖尿病早期肾病的诊断方面具有潜在的临床诊断价值。

2.3肾脏损伤分子1 肾脏损伤分子1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是一种跨膜糖蛋白,主要表达于人类肾脏,且在正常肾脏中并不表达,而在肾损伤发生后短时间内其表达明显增加。研究表明,KIM-1的外功能区在金属基质蛋白酶作用下断裂为可溶性片段并能够通过尿液排出,参与肾小管上皮细胞的早期损伤和修复过程，因此检测尿中KIM-1水平可以间接评价肾小管损伤的情况[16]。

Kramer等[17]的一项随访研究显示呈比例的减少蛋白尿可减少肾赃KIM-1的表达，提示KIM-1是潜在可逆性损伤的生物标志物。van Timmeren等[18]检测不同肾脏疾病患者组及健康对照组尿液中KIM-1水平与肾损伤程度进行相关分析，结果表明,与正常对照组相比,在所有肾脏疾病患者的尿液中KIM-1水平均明显增高。免疫组织化学检测显示,肾脏损伤时KIM-1与尿蛋白水平之间并没有明确的相关关系，尿液中KIM-1排泄增多提示肾脏功能的下降。研究结果提示，KIM-1可作为监测肾脏病损伤状态的非侵入性生物标志物。Nielsen等[19]对148例1型糖尿病者的研究显示，与55名健康对照组相比，在正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿的1型糖尿病患者中尿液KIM-1水平显著增高，但尿液KIM-1在糖尿病不同蛋白尿组之间差异无统计学意义，提示尿液KIM-1可作为检测肾小管损伤早期阶段的生物标志物。

3 炎性反应生物标志物

3.1α酸性糖蛋白 α酸性糖蛋白(αl acidglycoprotein，AAG)是一种含糖量高达45%的急性时相反应蛋白，主要由肝巨噬细胞产生，感染应激等状态下释放出来，成为有活性的蛋白。尿液中AAG主要由血液中AAG经肾脏滤出形成。Jain等[20]的研究首次提示了尿液AAG与DN的相关性，研究发现AAG只出现于糖尿病患者尿液中，即使检测对照者尿液的尿微量白蛋白阳性，尿液AAG仍为阴性；在尿白蛋白排泄率正常的2型糖尿病患者发展为早期DN的过程中，AAG在尿液中的出现时间较尿微量白蛋白更早，提示尿液AAG可作为检测肾损伤早期阶段的生物标志物。Jiang等[21]使用二维凝胶电泳和质谱分析蛋白质组学的方法识别检测12例DN患者(6例1型糖尿病和6例2型糖尿病患者)和6名健康对照者的尿液样本中的生物标志物，然后通过免疫比浊法化验检测尿蛋白生物标志物水平，尿液样本来自90例1型和2型糖尿病患者，其中包括正常蛋白尿组、微观蛋白尿组、大量蛋白尿组(各组)和30名健康对照者。结果显示，使用蛋白质组学方法确认了一个新颖的DN相关蛋白，即AAG。数据化验显示与对照组相比，尿液AAG排泄率在正常蛋白尿、微量蛋白尿和大量蛋白尿患者中逐渐增加，表明AAG排泄率在早期DN即增加且随着DN的发展逐渐增加。研究结果提示，尿液AAG是一个与DN的发生和进展相关的早期生物标志物，此外AAG排泄率增加是DN的一个独立危险因素。

3.2软骨糖蛋白40 软骨糖蛋白40 (chitinase-3-like-1 protein,YKL-40)，又称几丁质酶-3样蛋白1，是一种炎症性糖蛋白，可促进血管内皮功能障碍相关的趋化性，细胞黏附和迁移，重组和组织重构，血管内皮损伤的反应。YKL-40蛋白的表达被认为是在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞和平滑肌细胞,其在早期动脉粥样硬化病变的巨噬细胞中表达最高[22]。

Lee等[23]选择75例2型糖尿病患者和22例非糖尿病对照者，使用酶联免疫吸附测定试剂盒对血浆和尿液中的YKL-40的水平进行分析，结果表明血浆YKL-40显著高于正常白蛋白尿糖尿病组且随着糖尿病蛋白尿的增加而增加。血浆YKL-40与蛋白尿显著相关，而尿液YKL-40与蛋白尿没有表现出显著的相关性。研究表明，尿液YKL-40的作用有限，而血浆YKL-40作为炎性标志物，是伴有蛋白尿的2型糖尿病肾病早期阶段的一个独立因素，并有可能作为一种非侵入性的有用标志物。Rondbjerg等[24]对105例2型糖尿病患者和20名健康对照组的研究及Sakamoto等[25]对131例年轻的1型糖尿病患者和97健康对照组的研究均表明，YKL-40水平与尿白蛋白排泄率相关，YKL-40可以预测评估1型糖尿病患者早期阶段糖尿病微血管病的风险。

4 氧化应激生物标志物

尿8-羟基-2′脱氧鸟苷(8-hydroxy- 2′- deoxyguanosine，8-OHdG)是羟自由基在DNA碱基的C-4、C-5或C-8位置上与脱氧鸟嘌呤核苷酸残基结合并进一步氧化产生的，最近已经成为评估人类身体的氧化应激状况的一种受欢迎的手段。

赵林双等[26]随机选择DN患者71例，糖尿病患者73例及健康对照者47例，采用酶联免疫吸附实验法测定其血清8-OHdG水平，结果8-OHdG水平在DN组显著高于糖尿病组，糖尿病组显著高于健康对照组，大量蛋白尿组明显高于微量蛋白尿组。研究结果提示，DN与血清8-OHdG水平有关。检测尿8-OHdG水平预测DN发展是一个有用的早期临床标志物。

Serdar等[27]对52例2型糖尿病患者(32例肾病患者,20无肾病患者)和20名健康对照组进行研究，使用液相色谱-质谱/液相色谱法测定尿液中8-OhdG水平及第1日上午尿白蛋白/肌酐比值，结果表明，有或无肾病的2型糖尿病患者尿8-OHdG水平增加比较差异无统计学意义。然而，较尿白蛋白/肌酐比值，尿液8-OhdG水平在预测糖尿病患者DN的发展中不是一个有用的早期临床标志物。

5 小 结

DN生物标志物的研究取得了一些积极的进展，但仍需做大量的基础和临床工作。除采用蛋白质组学等新技术发现一些新的生物标志物外，另一个重要的研究方向是采用新的生物信息学方法重新整合分析已有的信息，从而更全面、深入地了解DN的发病机制及病理生理特点，发现更特意的DN早期诊断生物标志物，从而早期保护肾功能，减少终末期肾病的发生。

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