代谢组学分析方法在2型糖尿病中的应用研究

肖 继(综述)，闫卫利(审校)

(天津中医药大学第二附属医院检验科，天津 300150)

随着现代科学技术的不断创新和发展，基因组学、转录组学和蛋白质组学等都在生命的探究中取得了重要突破。代谢组学着重于分析相对分子质量<1000的小分子代谢物质[1]，在后基因组时代的生命科学研究中发挥着重要作用。代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等多学科交叉的一门新学科，它能对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定，是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，并且通过这种变化规律探究所发生的生物学事件或过程的本质。它是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学[2]重要的组成部分。

1 代谢组学分析方法

当前代谢组学研究的核心技术是磁共振技术和质谱技术。现有的分析方法基本上可以归为三类：磁共振波谱法、色谱-质谱联用方法和色谱-核磁-质谱联用法。

1.1磁共振波谱法 磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance，NMR)是利用原子核磁特性的一种波谱分析技术，分析分子内个官能团的连接结构和化学特性。磁共振技术具有明显的优势：①没有偏性，对样品中所有的物质灵敏度是一样的，而质谱存在离子化程度和基质干扰等问题；②具有无损伤性，可探测化合物内部结构而不破坏样品，样品不需要繁琐处理，可在接近生理条件下进行实验，因而便于活体、原位的动态检测；③可以进行实时和动态的检测，可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样。NMR氢谱的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的，所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰，图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量。因此，NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。但它的缺点是检测灵敏度相对较低，很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。

1.2色谱-质谱联用方法 色谱-质谱联用方法 (1iquid chromatography-mass spectrometre，LC-MS)技术已发展成为代谢组学研究的主流技术手段[3]，色谱分析是通过两相及两相的相对运动对分析物进行分离和分析的一种方法。质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。色质联用法将色谱仪的分离技术和质谱仪的定性定量鉴定技术相结合，是分离和鉴定同时进行，总体来说具有良好的客观性和分辨率，但该方法属于有偏向的选择性检测方法，需要对样品有介入性和破坏性而不利于在体和原位分析；需要对样品进行较为复杂的制备而且通量有限；对代谢组中各代谢物的原位定量十分繁琐，未知代谢物的定性(结构确定)有相当的难度。

1.3色谱-核磁-质谱联仪法 该方法以LC-MS和NMR为分析手段，对分析物进行平行动态分析，获取同一成分内在相关且互补的谱学信息，可实现复杂混合物体系组分群无需完全分离的同步分析鉴定[4]。

与构成核酸的4种碱基和构成蛋白质的20多种氨基酸不同，小分子代谢物的结构种类繁多，理化性质差异巨大，含量极微且动态范围极宽(7～9数量级)，时空分布的差异明显，相互作用方式复杂，无论定性、定量还是动态追踪，目前尚无完善的代谢物扩增技术和分析平台，因此多种分析平台方法的联合应用能够对代谢物进行全面的分析和了解。

2型糖尿病主要是由于胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能衰竭和胰岛素分泌障碍等因素引起机体代谢异常，出现葡萄糖、脂肪和蛋白质等代谢紊乱，代谢组学的应用有助于对于糖尿病的具体病因和发病机制进一步了解。

2 代谢组学在葡萄糖代谢机制的研究

2.1在动物模型的研究 遗传易患性、环境因素、精神压力、胰岛素抵抗、生活方式等都与糖尿病的发病有关，但确切的发病机制仍未明了。而利用糖尿病动物模型进行代谢物分析将有利于针对性的病因与发病机制研究。目前，国内外糖尿病动物模型主要分为实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病模型等。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)可以通过自由基损伤β细胞，使β细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病。小鼠多次小剂量注射STZ，可引发胰腺炎,制成免疫1型糖尿病模型,STZ可能通过细胞介导的自身免疫，更接近人类的1型糖尿病的发生、发展变化[5]。自发性动物模型是通过特定的改变动物生存条件，诱导动物自然发病，与人类某种疾病的发生、发展过程有相似之处。Fearnside等[6]通过对饮食诱导和遗传基因型的糖尿病动物模型的对比发现，饮食诱导的动物模型更能反映胰岛素抵抗的发生和糖尿病发病进程。Xu等[7]以瘦素受体基因剔除小鼠为糖尿病模型，取其肝左叶和肾皮质后行高分辨率魔角旋压NMR检测和代谢组学分析，结果显示，8周龄动物模型的肝组织代谢物变化显著，其中三酰甘油和胆汁酸升高明显，三甲胺-N-氧化物、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱及胆碱明显降低，但肾皮质未见显著不同。Shear等[8]通过对高脂肪喂养和正常喂养的实验鼠代谢物核磁共振氢谱分析，结果显示高脂肪喂养的白鼠的柠檬酸盐高于正常白鼠，而甘氨酸、赖氨酸、辛二酸盐、醋酸盐、亮氨酸、缬氨酸明显低于正常白鼠。此外，赖氨酸、甘氨酸、柠檬酸盐、亮氨酸、辛二酸盐等降低可能是胰岛素抵抗的潜在生物标志物。Lin等[9]在对高糖饲养和正常饲养的仓鼠进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)后，进行肝脏、骨骼肌和脑组织的MS代谢物分析，发现胰岛素与溶血磷脂胆碱的正向调节有关；高糖饮食能够增加肝脏和骨骼肌中的氧化应激，增高氨基酸的水平和改变脂肪酸生物合成，并且与大脑皮质和海马体中氨基酸水平和嘌呤生物合成的正向调节的降低有关。

2.2在糖代谢途径中的研究 OGTT是目前公认的诊断糖尿病的金标准，通过在空腹状态下的高糖刺激，检测机体对葡萄糖的代谢能力。Shaham等[10]研究发现，在OGTT正常人群中，餐后30 min后血浆中甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸显著升高，机体在摄入葡萄糖后，胆囊收缩增强，胆汁酸分泌增多，同时胆固醇7α-羟化酶mRNA的表达也增强，胆固醇7α-羟化酶基因编码胆固醇代谢过程中重要的限速酶即胆汁酸胆固醇7α-羟化酶。葡萄糖和胰岛素对胆固醇7α-羟化酶的表达提示胆汁酸代谢与葡萄糖的动态平衡存在着重要关联性[11]。Zhao等[12]对代谢物的研究发现，糖耐量受损人群血浆中甘氨鹅脱氧胆酸的水平高于正常人群。Kondo等[13]通过给予2型糖尿病患者胆汁酸相关治疗后，发现葡萄糖和糖化血红蛋白均有所减低。目前普遍认为脂质代谢异常所导致的脂肪异常分布，过度堆积是胰岛素抵抗的主要原因[14]。Li等[15]利用气相色谱/飞行时间质谱分析技术研究糖尿病患者和正常人的血浆，发现了葡萄糖等5种生物标志物，并提出以非酯化脂肪酸增多为标志的脂肪酸代谢异常可能是糖尿病的主要病因。Matsuzaka等[16]研究小组报道，长链脂肪酸家族Elovl6(elongation of long chain fatty acids family member-6)是一种用来催化软脂酸(C16∶0)转化成硬脂酸(C18∶0)的长链脂肪酸延长酶，在胰岛素的抵抗中扮演着重要角色。他们的实验结果表明，由软脂酸转化成硬脂酸的过程与胰岛素抵抗的发生息息相关。Yang等[17]借助代谢组学方法，通过对血清脂类代谢产物的分析,很好地实现了糖尿病患者与健康对照人群的分离，为糖尿病诊断提供了新的途径。

3 代谢组学在临床糖尿病药物机制中的研究

3.1西医药机制研究 临床上根据胰岛素发病机制，治疗糖尿病的药物分为胰岛素及其类似物、双胍类药物、磺酰脲类药物、α葡萄糖甘酶抑制剂等。尽管治疗糖尿病的药物很多，但其作用机制不同，药效和不良反应也不尽相同。代谢组学能够鉴定出患者用药后小分子物质生物化学变化，从多种代谢通路出发，构建药物与机体代谢途径及病理生理变化的关系，在药效评价中充当着重要角色。刘跃芹等[18]利用超高效液相-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法对阿卡波糖治疗2型糖尿病的药效进行代谢组学分研究，并对衍生化后的尿液进行了代谢轮廓分析，推断出阿卡波糖除具有α葡萄糖苷酶抑制剂的作用外，还能对体内的能量代谢通路、信号转导相关通路及肠道菌群代谢通路途径产生影响。

Huo等[19]研究了2型糖尿病患者服用二甲双胍后血清中内源性代谢物的变化，筛选出苯丙氨酸和乳酸等生物标志物。Bao等[20]利用基于气相色谱-质谱技术的代谢组学方法，分析了2型糖尿病患者服用瑞格列奈、二甲双胍、罗格列酮之后血清代谢水平的变化，结果发现服用这三种降糖药的患者都能显著下调血清中谷氨酸盐的水平，罗格列酮治疗组能够将更多异常代谢的化合物调到正常水平，提示罗格列酮治疗2型糖尿较其他两者更有效。

3.2中医药机制研究 中医药治疗糖尿病及其并发症具有悠久历史和不可替代的优势。中医学认为人是一个有机的整体。构成人体的各个组成部分之间在结构上不可分割，在功能上相互协调，在病理上相互影响。但由于中药成分复杂以及用药方式多样，显然仅以中医理论进行其药理的机制阐述已经不能满足现代科学对疾病治疗的要求，也限制了中医药的自身发展。代谢组学通过对研究对象进行高通量的分析，以“代谢指纹图谱”变化阐明中药有效成分和作用靶标，从而真正阐明中药的作用机制。王静等[21]采用气相色谱-质谱技术研究黄连治疗2型糖尿病的机制，结果表明黄连不仅具有降糖和降血脂的作用，而且具有抗氧化作用。GU等[22]应用代谢组学技术考察了小檗碱治疗2型糖尿病的潜在机制，结果显示，给药后糖尿病志愿者组血清中13种非酯化脂肪酸水平减少，其中10种有统计学意义，提示小檗碱可能是通过下调高水平的非酯化脂肪酸来发挥其治疗作用。

4 小 结

目前，代谢组学作为一门多学科交叉的新学科，其检测技术、实验性研究及临床应用中均取得了一定进展。但是研究平台间存在的差异以及生物标本的复杂性和现阶段分析技术的局限性，制约人们能从标本中分析出代谢物的程度，从而限制了代谢组学的发展。如何通过多分析平台的互补作用与其他组学结合，充分利用代谢组学的优势全面理解疾病的精确生物学过程仍需要不断探索。

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