线粒体介导的细胞凋亡与男性不育的研究进展

孔维元(综述)，张铁辉(审校)

(哈尔滨医科大学第五附属医院泌尿外科，黑龙江 大庆 163316)

男性不育症是指同居1年以上未采取任何避孕措施，由男性因素而使女方未能妊娠的不育症，约占所有不育不孕症比例的50%[1]。精子DNA损伤、精子活动下降与精子密度降低被认为是影响精子质量、致使男性不育的主要原因。而精子细胞凋亡率与上述因素关系密切，也可作为潜在的衡量精液质量和男性生育能力的一个重要临床指标。细胞凋亡是某些特定因素将机体内预存的死亡程序激活引起细胞的主动性死亡，亦称程序性细胞死亡，其可由激素变化、辐射、疾病等诸多因素诱发。而诱发细胞凋亡存在3条途径，分别为线粒体介导的凋亡途径、死亡受体介导的凋亡途径和内质网介导的凋亡途径，其中线粒体介导细胞凋亡与精子发生发育、精子质量、精子受精能力的关系尤为密切[2]。近年来对男性不育的研究中，线粒体介导的细胞凋亡途径正在逐步被人们认知。

1 线粒体介导的细胞凋亡

线粒体是细胞内重要细胞器,其参与三磷酸腺苷(ATP)合成，活性氧类(reactive oxygen species,ROS)的产生，钙信号的调节和细胞凋亡的介导。

1.1线粒体与细胞凋亡概述 在正常情况下，线粒体所产生的能量能够有效地供应细胞进行正常的应答反应；当刺激强度超出正常细胞可耐受的极限时，线粒体所产生的能量反而诱发细胞发生凋亡，以保证机体在最小损失的情况下结束细胞的生命进程[3]。线粒体在细胞凋亡过程中发挥枢纽性作用，线粒体通透性转换孔开放引起的跨膜电位下降出现在染色质浓缩、DNA断裂等细胞核凋亡特征出现之前，而线粒体一旦发生崩溃，则细胞凋亡的过程便不可逆转。参与凋亡相关的线粒体蛋白主要有：细胞色素C、B细胞淋巴瘤基因2(B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2)家族蛋白、凋亡诱导因子、天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族。

1.2线粒体介导细胞凋亡的机制 线粒体介导的凋亡途径主要与定位于或受信号刺激后转移到线粒体外膜的Bcl-2蛋白家族有关,Bcl-2与Bax分别作为Bcl-2基因家族细胞生存基因和死亡基因的代表。主要表达在线粒体上的Bcl-2蛋白，通过抑制干扰ROS的产生和减少脂膜过氧化的方式来发挥抑制细胞凋亡的作用；Bax蛋白则可以通过直接插入线粒体膜,引起细胞色素C释放入细胞质而诱导生精细胞的凋亡。线粒体主要通过Bcl-2与Bax两者表达的平衡来调节其通透性转换孔的开放与关闭，以此调控线粒体跨膜电位。Bax等促凋亡蛋白表达过量时，线粒体通透性转换孔开放后，继而线粒体跨膜电位下降，经过ATP/dATP参与，使细胞色素C释放进入胞质与凋亡酶激活因子相结合。凋亡酶激活因子可以激活caspase-9的前体蛋白，促使其自我剪切形成有活性的caspase-9蛋白酶，进而启动一系列的caspase级联反应，最终引发细胞凋亡。此外，近期研究发现[4],Bcl-2蛋白家族和Ca2+信号联系密切，如Bcl-2蛋白家族能改变内质网的Ca2+容量及在受刺激时Ca2+的释放速度，通过调节Ca2+信号间接调控细胞凋亡。由于线粒体基质的高渗性可以增大Ca2+摄取量，使线粒体内的Ca2+浓度超过线粒体容纳量的极限，引起线粒体外膜肿胀，最终导致其外膜的破裂，膜内间质溢出，促凋亡蛋白释放,发生细胞凋亡。另一方面在caspase非依赖性的细胞凋亡途径中，线粒体中的凋亡诱导因子和限制性内切核酸酶G受到凋亡信号刺激后从线粒体内释放，经细胞质进入细胞核，对细胞核DNA进行切割[5]。

2 线粒体介导的细胞凋亡与生精细胞

在精原细胞形成成熟精子的过程中，经过精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子形成，使睾丸生精细胞核和包括线粒体在内的细胞器发生急剧变化。而生精细胞中线粒体的供能功能也发生了变化：①在睾丸中，其可以为生精细胞的发生、分化和成熟提供能量；②在射精后的精子中，线粒体则为精子的活动供能。同时，线粒体介导的细胞凋亡在睾丸生精细胞、成熟的精子中的作用也略有差异。

2.1睾丸生精细胞中线粒体介导的细胞凋亡作用 在睾丸中，机体主要以细胞凋亡的方式来清除染色体畸形或受损的生精细胞，保持生殖细胞与支持细胞比率，从而确保正常精子的质量和数量[6]。线粒体介导的细胞凋亡途径在控制睾丸生精细胞凋亡中发挥着至关重要的作用。Vera等[7]在热应激诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的实验中发现，在FasL和Fas功能缺失(即介导细胞凋亡的死亡受体途径被阻断)的小鼠中,睾丸生精细胞的凋亡仍然存在，而在对热敏感野生型小鼠生精细胞的研究发现,Bax从胞质中转移至细胞核外,同时与在细胞核外的线粒体聚集,促使细胞色素C的释放,从而导致caspase-3的激活,提示线粒体介导的细胞凋亡途径是热应激诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡中发挥至关重要的作用。

2.2精子中线粒体介导的细胞凋亡作用 精子凋亡形态学特点可以表现为精子头部核异常、染色质固缩、质膜内磷脂酰丝氨酸外翻、膜起泡和凋亡小体的形成；但由于精子结构区域化、精子核染色质致密且其周围存在鱼精蛋白保护，使凋亡诱导因子和限制性内切核酸酶G难以到达核基因组，因此并非所用凋亡的精子都呈现体细胞凋亡那样典型的DNA片段化的结果[8]。在临床检测精子凋亡时通常可观察到精子头部凋亡的精子和其颈部中段凋亡的精子，提示位于精子头部的核DNA和精子颈部的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)发生损伤。Smith等[9]研究发现，精子只有处于氧化应激状态下,线粒体产生的过多ROS才能诱导细胞的DNA损伤；随后碱基切除修复酶OGG1被激活，裂解其因氧化而产生的碱基空缺；在ROS、脂肪醛和活化的caspase酶作用下导致细胞凋亡，同时使磷脂酰丝氨酸外翻，在此状态下细胞凋亡启动后的48 h，通过原位缺口末端标记法使凋亡的精子带有阳性标记，提示精子凋亡与线粒体产生的ROS关系密切，而线粒体介导细胞凋亡可能参与造成细胞核DNA的碱基空缺，染色质解聚的过程。

3 线粒体介导细胞凋亡与男性不育

精子DNA损伤、精子活动下降和精子数量减少等因素影响精子的受精能力，诸多因素的综合作用结果导致男性不育。线粒体介导的细胞凋亡通路的发现与导致男性不育这个病理生理过程的机制成为研究的热点。

3.1精子DNA损伤 精子DNA 损伤对生育的影响涉及到受精、卵裂、植入以及胚胎存活等诸多环节[10]，已被认为是一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标[11]。精子DNA损伤可以引起线粒体的氧化呼吸链功能障碍。郑九嘉等[12]对34例不同活力的精液标本研究，应用氧电极法测定精子线粒体呼吸功能，使用精子染色质扩散方法来检测精子损伤，发现精子DNA损伤程度与线粒体呼吸、氧化磷酸化功能之间存在紧密的联系；精子DNA损伤与线粒体状态Ⅲ呼吸耗氧、氧化磷酸化效率均呈极显著负相关(P<0.01)，提示精子DNA损伤程度越高,核基因和线粒体基因缺陷或变异就越严重，越可能严重地破坏线粒体的氧化呼吸功能；如果线粒体呼吸功能发生异常很容易造成线粒体膜电位下降,使ROS生成量增加,产生氧化应激反应,破坏呼吸链的正常运转，导致能量障碍,改变线粒体膜电位并增加内膜通透性，导致膜损伤，释放细胞色素C，从而诱发细胞凋亡。

3.2精子活动力下降 精子活动力是衡量精液质量和男性生育力的重要指标，精子活动力低下可能导致不育。研究发现[13]，不育症组患者的精子中caspase-3 和caspase-8的表达水平显著高于正常对照组，且精子中caspase-8的平均水平与精子活动性呈负相关，研究证实精子凋亡与精子活力密切相关，是评价男性不育的指标之一。

精子通过摆动尾部的鞭毛方式运动，而线粒体存在其尾部中段，正常情况下,精子通过无氧酵解产生ATP；而射精后，精子通过线粒体呼吸链氧化磷酸化产生的ATP为其运动供能，线粒体任何结构与功能的改变都会影响到精子的运动能力[14]。Barroso等[15]研究发现，形态正常但活动力低下的精子线粒体膜电位下降显著，凋亡率显著增高，而且不同活动力的精子凋亡率和线粒体膜电位损伤率之间存在高度的相关性，即精子凋亡率越高，其线粒体膜电位损伤率也就越大。同时大量研究证实[12，16]，精子活动力低下与精子DNA损伤密切相关，尤其是参与线粒体中多种肽的精子mtDNA；在过量的ROS作用下，缺乏组蛋白等保护性蛋白且自身修复损伤能力差的mtDNA的单链或双链可发生频繁断裂，致使mtDNA突变将破坏线粒体氧化磷酸化所需的合成蛋白，影响线粒体的呼吸功能，致使精子的活动力下降。研究发现[17]，弱精子症患者中，精子mtDNA中可发生突变，突变点为线粒体ATPase6基因上的T8821C点，该突变改变线粒体中氨基酸的编码，导致线粒体氧化呼吸链功能障碍，使精子的活动力降低；线粒体呼吸功能受损可以同时诱发细胞凋亡，提示线粒体介导的细胞凋亡与精子的活动力可能存在直接或间接的联系。

3.3精子密度降低 精子密度反映每毫升中精子的数量，与男性生育力关系密切。吕逸清等[18]研究发现，少精子症组精子细胞凋亡率显著低于对照组，精子凋亡率与精子密度之间呈显著负相关。精子发生是一个受到精密调控并具备周期性的动态过程，包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精细胞分化成精子。当睾丸微环境不支持精子发生时，可激活线粒体介导的凋亡途径，使睾丸中各级生精细胞大量凋亡。这可能是决定实际产生的精子数量少于精子应生成量的主要原因之一。

研究发现[19]，在双酚A诱导下的青春期小鼠生精细胞凋亡的实验中，在双酚A暴露的小鼠睾丸中的Bax和caspase-9的表达水平明显上调，使线粒体释放细胞色素C进入细胞质,进而使caspase-8和caspase-3表达水平升高，提示双酚A可诱使青春期小鼠的睾丸生精细胞通过线粒体介导的凋亡途径发生细胞凋亡。张端等[20]在精索静脉曲张可致睾丸组织缺氧损伤的实验中发现，缺氧诱导因子1α表达增加，并且发现缺氧诱导因子1α表达伴随病程进展持续上调，促使Bcl-2表达降低以及Bax表达升高，使睾丸生精细胞凋亡增加，进而影响睾丸的生精功能，提示缺氧可明显影响线粒体氧化呼吸功能，改变Bcl-2和Bax基因表达的水平来诱导睾丸生精细胞凋亡，影响睾丸生精功能。综上所述，模拟各种可能导致男性不育的疾病的实验证实了睾丸中生精细胞与线粒体介导的细胞凋亡途径密切相关，可能影响精子生成数量，继而改变精子密度，可能导致男性不育症。

4 展 望

线粒体介导的细胞凋亡途径参与精子的发生、分化、成熟，影响精子的质量及活动力，其与男性生育能力密切相关。在大多数男性不育患者中，ROS水平升高、线粒体损伤功能障碍与精子凋亡率正相关。随着研究的不断深入，人们已经认识到线粒体介导的细胞凋亡途径在男性不育中的重要性。近年来，在男性不育的研究中发现男性生殖细胞线粒体介导的细胞凋亡与各种细胞信号转导通路(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号转导通路、JNK信号转导通路等)存在联系，但其与其他信号途径之间的关系尚未阐明。深入研究线粒体介导的细胞凋亡与其他通路的区别和联系可从机制水平上进一步认识男性不育症，并为临床治疗提供充分的理论依据。

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