手性药物分析方法研究进展

杨沐，钟文英，侯雯

(1. 中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009；2. 南京卡文迪许生物工程技术有限公司，江苏 南京 210033)

手性药物分析方法研究进展

杨沐1,2，钟文英1*，侯雯2

(1. 中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009；2. 南京卡文迪许生物工程技术有限公司，江苏 南京 210033)

综述了近10年来手性药物分离检测方法的发展，包括高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法，以及超临界流体色谱法等，旨在为该领域的进一步发展提供参考。

手性药物；手性分析；对映异构体

组成生物体的重要分子多为手性物质，如氨基酸、糖、蛋白质以及核酸等，然而实际上它们多以单一对映体形式存在，因此在疾病治疗中开启该“锁”需要与之唯一匹配的“钥匙”，即单一对映体的手性药物分子。

目前世界范围内市售药物中逾三分之一具有手性结构，新药多倾向于以单一对映体形式申报[1]。手性药物对映体多呈不同的药理活性，代谢动力学过程以及毒性方面也存在着显著的差异。如(S , S)-乙胺丁醇具有抗结核作用，而(R , R)-型异构体则会导致失明。因此，手性药物需更加关注其用药的安全性。

为了深入探寻手性药物对映异构体的生理活性与药理作用，手性药物分析得到迅速发展，成为药学研究的重要领域之一。近年来，针对手性药物分析方法的较为全面的综述报道仅有1篇[2]，且侧重于手性拆分，其他有关手性药物分析方法的综述大多是单独对某一种分析方法进行介绍，如气相色谱（GC）法[3]、液相色谱法[4-5]、毛细管电泳法（CE）[6]以及超临界流体色谱（SFC）法[7-8]等。本文全面地综述手性药物的常用分离分析方法，旨在为该领域的进一步发展提供参考。

1 手性HPLC法

手性HPLC法是20世纪70年代发展起来的，适用于极性强及热稳定性差的手性药物分析。HPLC法拆分对映体有直接法和间接法2种方法，其中前者又分为手性流动相添加剂法和手性固定相法，后者即为手性衍生化试剂法（CDR）[2]。

1.1 手性流动相添加剂法

手性流动相添加剂法分离测定手性异构体分为2种途径：1)添加的手性试剂与对映体作用形成非对映配合物，表现出不同的色谱行为从而实现分离检测；2）手性添加剂与固定相作用形成动态修饰的手性固定相，其与对映异构体之间的吸附作用有明显差异，从而实现对映异构体的拆分。该法的优点是无需柱前衍生化，对固定相无特殊要求，且样品可进行可逆的非对映异构体化配位，利于制备；缺点是应用范围有一定局限性，某些手性流动相添加剂可能不稳定，会干扰检测。

Huang等[9]以磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）为手性流动相添加剂，采用反相HPLC法对4种分子中含有N-烷基结构的外消旋体药物（盐酸昂丹司琼、舒必利、盐酸克伦特罗和奥美拉唑）进行了手性拆分，分离效果良好。该课题组同样也研究了环糊精的类型以及浓度对试验结果的影响，即分别以β-CD、羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）以及SBE-β-CD为手性流动相添加剂检测上述4种药物的对映异构体，结果表明只有SBE-β-CD体系能够到达有效分离；随着SBE-β-CD浓度的增加，对映体的分离度逐渐增加，但是增加至一定浓度后即达到饱和，且随着手性添加剂的浓度增加，柱压随之增加，柱效降低，因此需选择一个较为合适的浓度。该方法适用性良好，可用于大部分含有N-烷基结构的重要生物手性对映体的分离分析。

Keunchkarian等[10]将手性配体交换试剂——金鸡纳生物碱与2价铜离子的配合物添加到流动相中，采用传统非手性色谱柱对α-氨基酸消旋体进行了手性拆分。试验中发现，在流动相中添加等物质的量的2价铜离子与金鸡纳生物碱如辛可尼丁、奎宁或奎尼丁时，α-氨基酸与2价铜离子形成非对映体后可在该体系下得到分离；此外，应用该方法时，可通过调节流动相中某些因素如pH值和甲醇的比例来得到适宜的保留时间和对映选择性。

此外，Alizadeh[11]利用L-丙氨酸与Cu2+形成的手性配体试剂在C8柱（250 mm×4.6 mm，10 µm）上对阿替洛尔对映异构体进行了手性分离分析。试验中流动相为水-甲醇（70∶30），其中L-丙氨酸与Cu2+的比例为2∶1，检测波长275 nm，进样体积15 µL。研究还发现待测样品在C8色谱柱中的分离效果优于C18色谱柱。该方法可用于分析合成样品或人体血浆样品。

1.2 手性固定相法

手性固定相法应用较为广泛，适用于各类化合物，可用于常规样品及生物样品的分析测定，定量分析方便可靠，然而有时样品仍需柱前衍生化，对样品结构有一定要求，且价格昂贵。

Wang等[12]利用HPLC法对2010年版中国药典收录的8种外消旋药物（尼群地平、非洛地平、奥美拉唑、吡喹酮、舒必利、盐酸克伦特罗、盐酸维拉帕米、马来酸氯苯那敏）进行了分离分析。实验中采用的条件如下：以直链淀粉衍生物为手性固定相的Chiralpak AD-H色谱柱或Chiralpak AS-H色谱柱，流动相为正己烷与异丙醇的混合溶液，流速为0.7 mL·min-1，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃。碱性有机改性剂质量分数为0.2%时分离度最佳。

α-糖酸蛋白（AGP）非常稳定，可作为手性选择剂制备得到反相手性色谱柱，用途广泛。Dubey等[13]采用手性AGP色谱柱对非麻醉性镇痛剂酮咯酸外消旋体进行了手性拆分以及检测。优化后的实验条件为：流动相为0.1 mol·L-1磷酸钠缓冲液（pH 4.5）-异丙醇（98 : 2），流速为1.0 mL·min-1，样品采集时间为15 min，紫外检测器检测波长为322 nm。在该条件下，对映异构体之间可达到基线分离（R=2.3）。该方法简便、选择性强、精密度高，适用于酮咯酸的检测。

研究人员对直链淀粉的苯基氨基甲酸酯衍生物中苯基的邻位和间位分别进行取代，制得不同的手性固定相，通过考察发现间位取代物对对映体的分离效果优于邻位取代物，且间位取代基不论是吸电子基团还是供电子基团均可改善对对映异构体的分离效果。此外，取代基的性质和数量同样也对分离有影响[14]。

1.3 手性衍生化试剂法

当某些样品不宜直接拆分，或需提高其检测灵敏度，以及需增加色谱体系的对映选择性时，可选用手性衍生化试剂法。其应用条件较为简便，可采用普通固定相与流动相，且该法有助于增加紫外或荧光检测器的检测灵敏度。然而手性衍生化试剂法的局限性在于，其对衍生化试剂的光学纯度要求较高，且各异构体衍生化速率可能不同，从而影响到检测效果。

研究人员建立了粟酒裂殖酵母的D-氨基酸氧化酶测定系统[15]。D-氨基酸在D-氨基酸氧化酶的催化作用下生成相应的α-酮酸后再与1,3-苯并二茂-5,6-二胺（DMB）在有机溶剂中反应，所得到的荧光化合物可在HPLC中分离定量，同时L-氨基酸的非酶促脱氨被抑制，避免了对D-氨基酸检测的干扰。该方法解决了传统HPLC方法中L-氨基酸信号峰掩蔽D-氨基酸信号峰的问题。

Eto等[16]建立了一种超高效液相色谱法，可快速全面检测分析蛋白质氨基酸的D-型及L-型对映异构体。在该方法中，手性衍生化试剂为4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂二唑（NBD-F），检测器为圆二色谱，分析时间可缩减到5.5 min，且灵敏度高。该法可有效地分析及控制食品中D-氨基酸的含量。

2 毛细管电泳法

高效毛细管电泳（CE）法与其他方法相比，具有分离效能高、拆分模式多、成本较低的优点[17-18]，因而成为目前手性分离分析的重要方法之一。

对于复杂样品的分析，近年来二维毛细管电泳（2DCE）备受关注。张效伟等[19]将区带电泳毛细管和胶束电动毛细管通过一段带微孔的聚四氟乙烯套管固定，搭建成二维毛细管电泳分离平台。该方法用于分离分析鼠尿样品中吲哚洛尔、普萘洛尔、尼莫地平和尼群地平4种手性药物及其对映体，灵敏度高、重复性好、分离度佳，实现了尿样中多种药物及其对映体的同时分离。

毛细管电色谱近些年发展较为迅速，尤其是整体柱的制备，克服了传统填充柱制备过程复杂等缺陷。雷雯等[20]将伊瑞霉素键合到甲基丙烯酸酯整体柱表面，制备得到手性毛细管整体柱，并在电色谱模式下考察了其拆分性能。课题组通过对有机改性剂种类、缓冲液pH值以及缓冲液浓度等条件进行考察后得到优化的色谱条件，并在该条件下对罗格列酮和5种氨基酸进行了手性拆分，均达到基线分离，结果表明该手性毛细管柱拆分能力强，分析速度快。

文拉法辛分子中含有电化学发光（ECL）最强的叔胺基团，因而有还原性，适于电化学发光法检测。研究人员优化实验条件，并在此条件下对文拉法辛对映异构体进行了检测，条件为：检测电位1.15 V，三联吡啶钌浓度为5 mmol·L-1，检测池pH值为9.0，检测池缓冲液浓度为80 mmol·L-1，手性选择剂为磺化-β-环糊精（S-β-CD，浓度为12 mmol·L-1），分离缓冲液浓度为30 mmol·L-1（pH3.0），进样电压为13 kV，进样时间为12 s，分离电压为15 kV。结果发现这2种对映异构体在0.1～1 000 µg·L-1质量浓度范围内与发光强度均呈良好线性关系，检测限分别为0.01和0.05 µg·L-1，平均回收率为94%～100%，相对标准偏差不大于3.2%，该方法灵敏度高、快速、经济[21]。

研究人员以双（6-氧-β-羧甲基-1,4-丁烯二酸单酯）-β-环糊精（DOCB-β-CD）为CE法手性添加剂，对2种药物手性对映体和4种氨基酸进行分离研究。实验中分别考察了各物质获得最佳分离效果的缓冲液浓度、pH大小以及电压大小。结果表明，对于D-和L-苯丙氨酸、D-和L-色氨酸，D-和L-酪氨酸、D-和L-组氨酸、罗格列酮和酮洛芬获得最佳分离度的条件如下：缓冲液质量浓度分别为24、20、18、20、24及24 g·L-1，缓冲液pH值分别为3.5、3.5、4.0、3.5、6.5及5.5，分离电压分别为20、15、15、20、25及25 kV。此外，最佳毛细管分离温度为15 ℃。该方法操作简单，分析时间短，待分离物质可达到基线分离，适用于手性药物的分离分析[22]。

3 气相色谱法

气相色谱（GC）法较早用于分离手性药物，与其他分析方法相比具有精确、快捷、识别能力强等优点，但是所测样品必须具有热稳定性和高度挥发性，因而限制了适用样品的种类[23]。

GC法同样可分为直接和间接分析2种方式。直接法即用装有对映体拆分试剂的手性固定相色谱柱拆分对映异构体，间接法为使用手性拆分试剂将对映体转化成非对映异构体后进行分析。

3.1 手性固定相法

手性固定相法利用固定相的手性提供分离所需的环境，该法无需制备非对映异构体衍生物，不会对对映体的组成造成影响，操作简便，测定结果可靠。

2004年，Ding等[24]首次将手性离子液体运用于GC，其在GC领域已获得成功应用。李芙蓉等[25]合成了一种具有手性识别能力的手性离子液体——L-丙氨酸叔丁酯双三氟甲烷磺酰亚胺（L-AlaC4NTf2），将其作为气相色谱固定相（A柱），同时将L-AlaC4NTf2与OV-1701按85 : 15的质量比混合制得B柱，按50 : 50的质量比制得C柱，分别考察了其色谱性能。课题组对醇类、酮类、芳香族化合物、位置异构体以及5种外消旋化合物进行了手性拆分，结果发现只有A柱能够达到全部分离，B柱和C柱只对部分手性化合物具有分离效果。这种手性离子液体作为气相色谱固定相具有广泛的分离能力，有良好的应用前景。

尹明明等[26]通过在β-环糊精的2,6-位引入乙氧乙基，3-位引入三氟乙酰基合成得到2,6-二-O-乙氧乙基-3-O-三氟乙酰基-β-环糊精作为毛细管手性固定相，并对其性能进行考察。实验中测试了10种手性化合物如α-甲基对氯苯乙腈、1-(2′ -硝基苯基)-乙醇、α-取代丙酸酯化合物和丙炔醇酮乙酸酯等在该色谱柱上的分离情况，结果发现该固定相对于7种α-取代丙酸酯化合物有良好的分离效果，其中2-溴丙酸、2-羟基丙酸、2-甲磺酰基丙酸的甲酯衍生物的分离效果均优于乙酯衍生物，表明该固定相对烷基侧链较短的对映异构体的手性选择性更强。

3.2 手性衍生化试剂法

采用手性试剂衍生化方法测定的手性药物化学结构中应含易于衍生化的基团，如羟基、羧基和氨基等。手性衍生化后仍不能气化的对映体可进行硅烷化反应，提高挥发性。

研究人员对碱性溶液中的β-受体阻滞剂进行氧甲酰衍生化后进行三甲基硅烷（TMS）衍生化[27]，使用极性不同的色谱柱DB-5和DB-17双柱模式，采取气相色谱法分析测定。实验中对15种β-受体阻滞剂进行了测定，单次运行33 min内2种物质（吲哚洛尔和卡拉洛尔）达到基线分离（Rs≥1.58），5种（丙萘洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、比索洛尔和倍他洛尔）达到部分分离（Rs≤1.21），而另外8种未能达到有效的对映体分离。

4 超临界流体色谱法

超临界流体色谱（SFC）法不论是硬件系统还是软件系统均与HPLC法相似，其流动相是以CO2为主的三元或四元混合组分。SFC法与HPLC法相比具有平衡速度快、分析周期短、高通量、污染小、经济实用等优点。而另一方面，SFC泵系统必须有冷却泵压头以保证CO2的液体状态，紫外检测或者质谱检测必须保持给整个系统加压[28]。

吡嗪酮类药物结构中母核N原子所连的C原子具有手性，此类药物是强效的促肾上腺皮质激素释放因子-1受体（CRF1R）拮抗剂。Qian-Cutrone等[29]通过对8种结构特征不同的吡嗪酮类物质的分离情况来考察SFC方法对该类药物的适用性。结果显示，分子结构中具有1-环丙基-2-甲氧基乙基亚基结构的吡嗪酮类药物在Chiralpak AD-H和Chiralcel OD-H色谱柱上都可得到有效分离，但是当其类似物中取代基结构为极性较低的烷基结构时，一般方法难以适用，需进一步优化色谱条件。此外，吡嗪酮母核与芳族取代基团的不同也会使手性拆分效果产生差异。

De Klerck等[30]在含甲醇的流动相中同时加入碱性添加剂异丙胺（IPA）和酸性添加剂三氟乙酸（TFA），使用SFC法在4种基于多糖的手性固定相（包括Lux®Cellulose-1、Lux®Cellulose-2、Lux®Cellulose-4和Lux®Amylose-2）上分别对59种手性药物进行了分析。实验结果表明，在流动相中同时加入IPA和TFA明显较单独添加时的分离效果好。此外，在实验过程中，应控制添加剂的浓度以降低所形成的盐的浓度，如IPA和TFA的质量分数均降至0.1%可防止盐的析出，从而避免对峰形及仪器的不良影响。

研究人员采用SFC法对氯吡格雷手性对映体进行分离与定量分析[31]，流动相为含有改性剂的CO2，并在该方法下考察了不同改性剂、进样量、温度、压力以及流体密度对分离效果的影响。结果发现，有机改性剂的种类和含量对分离效果的影响最大，而温度和压力较小。试验中对方法的线性、精密度、准确度、耐用性、检测限与定量限等进行了验证。研究结果表明，该法具有快速、准确、高效的优点，可用于实验室的常规分析。

5 其他分析方法

除了上述4种方法外，手性薄层色谱法（TLC）、高速逆流色谱法（HSCCC）和核磁共振法（NMR）也可用于手性药物分析。

氟比洛芬具有手性中心，其S_ (+) _型异构体的抗炎活性较R_ (-) _型异构体更高，且副作用较少。Bubba等[32]使用非商业化的三乙酸微晶纤维素（MCTA）板用来直接分离和定量分析R_ (-) _型异构体的纯度。课题组以乙醇-乙酸（60∶40，pH 3.0±0.1）为洗脱剂进行分离，结果显示，二者分离度为2.0，测得R_ (-) _型异构体约占1%，定量限和检测限分别为50和25 ng。

HSCCC法无需固体载体，可避免污染，成本低，但其分离效率低，实现手性对映体的拆分相对较为困难[33]。Tong等[34]建立了HSCCC法对苯丁二酸（PSA）对映体进行了手性拆分。该方法以HP-β-CD为手性选择剂，两相溶剂体系为正己烷-甲基叔丁基醚-0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液（0.5 : 1.5 : 2，pH 2.51）。课题组在优化色谱条件下分离了712 mg PSA外消旋体，经HPLC法检测显示，各对映体的纯度均在98.5%以上。

NMR法分离手性药物的原理为将对映体转化成非对映异构体，或者提供手性环境使二者的核磁共振信号产生差异。Redondo等[35]采用1H-NMR对平喘药物孟鲁司特进行了手性分析，并考察了9种不同的手性溶剂的分离效果，即D-二苯甲酰基酒石酸、D-二甲苯甲酰基酒石酸、(+)-樟脑酸、S-联萘酚、S-3,3′-二苯基-2,2′-联萘-1,1′-二醇、R-3,3′-二-9-蒽基甲氧基-1,1′-联-2-萘酚、R-3,3′-二-9-菲基-1,1′-联-2-萘酚、Pirkle醇和(-) _辛可尼丁。结果发现，大部分溶剂都能使孟鲁司特形成非对映异构体，从而可检测R-型异构体中S-型杂质的含量；就NMR手性识别能力和实验条件的易得情况而言，(-) _辛可尼丁作为手性溶剂较为合适。

6 结语

随着手性药物的需求量日益增加，人们对其重要性有了充分的认识，从而促进了手性药物分析研究的迅速发展。手性药物对映体纯度测定的最快速有效的方法为手性色谱法，目前手性HPLC法和CE法应用最广，通过选择不同的手性衍生化试剂、手性固定相、手性添加剂或检测方法可分离分析各种不同结构的化合物。不过，上述手段各有其局限性，例如，手性固定相成本太高，手性添加剂方法则较为复杂；GC法开发较早，技术较为成熟，然而其对样品的热稳定性和挥发性要求较高。目前，SFC法正处于快速发展的时期，其发展趋势是研制粒径更小（粒径小于2 µm）的填充色谱柱[36]。SFC法分离效率高，适用范围广，可弥补HPLC法与GC法的不足；此外，该法为绿色环保的药物分析方法，且分析速度快。可以相信，SFC法具有广阔的应用前景，且今后将会在手性药物分析中占有重要的地位。

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Advances in Research on Analytical Methods of Chiral Drugs

YANG Mu1,2, ZHONG Wenying1, HOU Wen2
(1. Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Nanjing Cavendish Bio-Engineering Technology Co., Ltd., Nanjing 210033, China)

The advances in research on methods of separation and detection for chiral drugs in recent ten years have been reviewed in this paper, including high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), capillary electrophoresis (CE), supercritical fluid chromatography (SFC), etc.. All these may provide references for the further development of the analytical methods.

chiral drug; chiral analysis; enantiomer

TQ460.72

A

1001-5094（2014）03-0209-06

接受日期：2014-01-25

*通讯作者：钟文英，教授；

研究方向：药物分析及分析化学；

Tel：025-86185217；E-mail：wenyingzhongnj@163.com