响应面法优化红曲酸奶的发酵工艺

肖昌贵，刘志彬，张雯，倪莉

（福州大学食品科学技术研究所，福州350108）

响应面法优化红曲酸奶的发酵工艺

肖昌贵，刘志彬，张雯，倪莉*

（福州大学食品科学技术研究所，福州350108）

利用超声辅助浸提法获得红曲米有效成分，用于酸奶的发酵，制备新型红曲酸奶。通过单因素试验筛选出红曲米添加量、菌种接种量、发酵时间为影响红曲酸奶感官品质的主要因素，并采用中心组合设计和响应面法优化参数。结果表明，最优发酵工艺为红曲米添加量4.8%，菌种接种量4.2%，发酵时间5.5h，在此条件下，发酵所得产品组织细腻，颜色均匀，酸甜适中，感官评分95.3分，与模型预测值基本相符。

超声辅助浸提法；响应面法；红曲酸奶；感官评定

红曲（Monascus）是一种腐生丝状真菌，最早发现于中国，至今已有一千多年的应用历史。红曲米是以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，经接种红曲霉属真菌发酵制备而成的棕红色或紫红色米粒，因其含有红色色素，已经在世界范围内广泛应用[1]。近几十年来，科学家先后发现红曲霉能够产生多种具有生理活性的次级代谢产物，如麦角固醇、莫纳可林K（Monacolin K）和γ-氨基丁酸等，其产物不仅营养丰富，而且具有抗氧化、抗衰老、降血压、降胆固醇、参与机体代谢和免疫调节等生理功效[2-7]，因此在食品、医药等领域有着重要的应用价值。

酸奶是以全脂乳或脱脂乳作为发酵基料，经过乳酸菌或其他益生菌发酵而成的酸性凝乳状饮料，具有营养丰富、易于消化吸收等特点，是一种可以提高人体免疫力，降低血液中的胆固醇，调节肠道菌群平衡的健康食品[8-10]。目前以红曲米为原料进行酸奶发酵工艺的研究，国内外的文献鲜有报道。成剑峰[11]将红曲制剂与发酵好的酸奶成品直接混合，均质后得到具有红曲复合香气的新型酸奶。王荣荣等[12]将红曲米磨成粉末，制成了新型红曲米南瓜发酵酸奶，成品色泽诱人、组织状态良好、风味独特，营养价值高。这类产品由于没有对红曲米进行前处理，成品易产生红曲米沉淀。同时发酵时可利用的红曲米量过少，对酸奶的整体品质影响较小；而当添加量过大时，酸奶易分层、口感不佳难以入口，这大大的限制了红曲米在酸奶发酵体系的应用范围。本研究通过对红曲米进行粉碎、超声浸提、抽滤等前处理，克服了现有的制备工艺中易产生红曲沉淀、分层难以入口的不足，并以红曲酸奶感官品质评分为考察指标，通过响应曲面法（response surface methodology，RSM）[13]对发酵工艺进行优化，使制得的产品色泽均一、口感顺滑、香气协调，为红曲酸奶的研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂奶粉：光明乳业有限公司；红曲米：市售可食红曲米；酸奶浓缩冻干发酵剂（嗜热链球菌2×1011CFU/g、保加利亚乳杆菌5×1010CFU/g）：杜邦丹尼斯克公司；太古优级白砂糖：市售。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台：苏州圣金净化科技有限公司；HZP-150型全温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HX-100型高速中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具厂；BSA124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-100DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；YXQ-LS-7 5SII立式蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；BCD-212（KK21V21TI）冰箱：博西华家用电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红曲酸奶的制备工艺流程

1.3.2 红曲米的前处理

将精选的市售可食用红曲米经粉碎机磨碎并过80目筛，得到红曲米粉；然后在红曲米粉中加入蒸馏水，在超声装置中超声20min，充分提取红曲米中的营养成分[14]，并在室温条件下充分浸提2h，整个过程不断搅拌；将所得到的溶液进行抽滤，即得红曲米粉滤液。

1.3.3 发酵剂的准备

超净工作台上选用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以1∶1的比例接种到经过121℃、5min灭菌处理后冷却的脱脂奶培养基中进行培养，在37℃培养24h，充分活化乳酸菌，置于4℃保存，待用。

1.3.4 红曲酸奶的发酵

在质量浓度为12%的全脂奶粉中，按比例依次加入红曲浸提液8%的蔗糖以及0.1%的复合稳定剂，在无菌室温条件下水化2h，充分溶解，得到酸奶发酵液；将发酵液分装到灭菌瓶中，在90℃水浴保温5min；发酵液冷却至37～43℃时，在无菌条件下添加酸奶发酵剂，接种后不断搅拌2min，使菌种均匀分布于灭菌瓶中；将所述灭菌瓶置于40～43℃恒温发酵，直至pH值为4.3～4.5，或滴定酸度在70～80°T，在无菌条件下冷却至室温，然后移入4℃冰箱中后熟12～24h，即得红曲酸奶。

1.3.5 红曲酸奶感官评定

采用五分标度法对红曲酸奶感官值进行分析[15]。根据红曲酸奶的香气、滋味、色泽以及凝乳状态等能反映其质量的评价指标，由经过严格感官培训的10人组成的评价小组进行感官评分（满分100分），感官评分标准见表1。

表1 红曲酸奶感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard ofMonascusyogurt

1.3.6 单因素试验确定影响因素

[16]，固定全脂奶粉添加量为12%，选定红曲米添加量、发酵时间、菌种接种量、蔗糖添加量这四个因素分别考察对红曲酸奶感官的影响，根据单因素试验结果和实际情况从中筛选因素进行中心组合试验。

1.3.7 响应曲面优化红曲酸奶发酵工艺

确定试验因素后，根据Box-Behnken中心设计原理设计试验，以感官评分为响应值，确立酸奶的最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 红曲米添加量对酸奶感官品质的影响

固定酸奶发酵剂接种量5%、蔗糖添加量8%，在发酵时间5h条件下，研究红曲米添加量（3%、4%、5%、6%、7%）对酸奶感官评分的影响，结果见图1。

图1 红曲米添加量对酸奶感官品质的影响Fig.1 Effect ofMonascusrice addition on sensory quality of yogurt

由图1可知，随着红曲米添加量的增加，酸奶感官评分提高；当红曲米添加量为5%时，酸奶凝乳状态良好，组织细腻不分层，感官品质最优；当红曲米添加量超过5%时，酸奶感官评分开始下降，这可能是由于红曲米添加量过大导致酸奶有轻微涩感造成。因此，选择5%红曲米添加量进行后续试验。

2.1.2 接种量对酸奶感官品质的影响

固定红曲米添加量5%，发酵时间5h，蔗糖添加量为8%，研究接种量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）对红曲酸奶的感官评分的影响，结果见图2。

图2 菌种接种量对酸奶感官品质的影响Fig.2 Effect of inoculum on sensory quality ofMonascusyogurt

由图2可见，接种量对红曲酸奶感官品质影响很大。当接种量为2%时，酸奶发酵5h后还未凝结，发酵未完全，此时酸奶感官评分值低。当接种量大于2%时，酸奶感官评分开始增加，酸奶的凝乳状况开始变好；当接种量达到4%时，此时酸奶的感官评分最高；接种量继续增大后，酸奶滋味开始变酸，感官评分开始下降。这可能是因为菌种接种量的增大，使单位面积内的乳酸菌含量增多，乳酸含量增多，当接种量过低时，产生的乳酸较少，体系内pH达到蛋白等电点，酸奶凝乳不完全，口感较差；接种量过高时，产生的乳酸过多，整体酸度过大，不适入口。因此，选择4%的酸奶发酵剂接种量进行后续试验。

2.1.3 发酵时间对酸奶感官品质的影响

固定红曲米添加量为5%，菌种接种量为4%，蔗糖添加量为8%，研究发酵时间（3h、4h、5h、6h、7h）对酸奶感官品质的影响，结果见图3。

图3 发酵时间对酸奶感官品质的影响Fig.3 Effect of fermentation time on sensory quality ofMonascusyogurt

由图3可知，发酵时间对酸奶的感官品质影响很大。当发酵时间为3h时，乳酸菌增殖不足，乳酸含量较少，酸奶未完全凝结，口感较差；当发酵时间达到5h时，酸奶的感官评分最高，随着发酵时间的增加，乳酸菌含量增多，乳酸产量也增大，酸奶凝乳状况变好；但发酵时间大于6h后，乳酸菌产生的乳酸含量过多，酸奶pH值较低，导致酸奶略酸，同时有少量乳清析出。因此，选择5h作为酸奶发酵时间比较适宜。

2.1.4 蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响

固定红曲米添加量5%，接种量4%，发酵时间5h，研究蔗糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）对酸奶感官品质的影响，结果见图4。

图4 蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响Fig.4 Effect of saccharose addition on sensory quality of Monascusyogurt

由图4可知，蔗糖添加量对酸奶感官品质影响不大，感官评分整体上变化不大；当蔗糖添加量为8%时，此时酸奶口感最佳，感官评分最高，因此蔗糖添加量选择8%比较适宜。

2.2 响应面优化试验

综合单因素试验所得结果，固定蔗糖添加量为8%，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取对酸奶感官品质有影响的红曲米添加量（A）、接种量（B）和发酵时间（C）这三个因素为自变量，以酸奶感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6软件进行3因素3水平的响应面试验优化，试验因素与水平见表2，响应面分析结果见表3。

表2 响应面分析因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2.3 回归模型的建立及方差分析

利用软件对试验结果进行二次多元回归拟合，对表3中的数据进行多元回归拟合，获得回归方程：

软件分析得到方程的相关系数R2=0.978 4及R2adj= 0.950 6，表明模型可以解释95.06%的凝固型红曲酸奶品质的变化，进一步说明了回归方程的拟合程度较好，可以用此模型对凝固型红曲酸奶品质进行预测。

表3 响应面分析结果Table 3 Results and analysis of response surface methodology

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

回归方程方差分析结果见表4。由表4可知，整体模型极为显著（“P＞F值”＜0.001）；失拟项（P=0.209 3＞0.05）不显著，说明方程的整体拟合度良好。从表4中还可以看出，二次项A2对结果得影响高度显著（P＜0.000 1），一次项A、B、C，二次项B2、C2，交互项BC对结果影响是显著的（P＜0.05），交互项AB，AC对结果影响不显著。由主因素A、B、C的F值可知，各因素对红曲酸奶感官品质影响的次序为发酵时间＞接种量＞红曲米添加量。

2.4 多因素交互作用响应曲面图分析[17]

图5～图7为主要影响因子对响应面值的响应曲面及等高线图。

图5 红曲米添加量与菌种接种量对酸奶感官品质的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line ofMonascusrice addition and inoculum on the sensory quality of yogurt

由图5可知，等高线接近圆形，说明红曲米添加量和接种量两个因素的交互作用很小；此外，在等高线图上，菌种接种量变化趋势更快，可以看出菌种接种量的影响要大于红曲米添加量对酸奶感官品质的影响。

由图6可知，等高线图表现为椭圆形可知，发酵时间与菌种接种量的交互作用显著，此外，等高线图上还可以看出发酵时间的变化趋势大于菌种接种量的变化趋势，说明发酵时间对红曲酸奶感官品质的影响要大于菌种接种量对红曲酸奶感官品质的影响。

由图7可知，等高线图接近圆形，说明发酵时间与红曲米添加量交互作用很小，此外，等高线也可明显看出发酵时间的变化趋势快于红曲米添加量，说明发酵时间比红曲米添加量对酸奶感官的影响相对较为显著。所以，选择适当的发酵时间对红曲酸奶的品质尤为重要。

图6 发酵时间与菌种接种量对酸奶感官品质的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of fermentation time and inoculum on the sensory quality of yogurt

图7 红曲米添加量与发酵时间对酸奶感官品质的响应面和等高线Fig.7 Response surface plots and contour line ofMonascusrice addition and fermentation time on the sensory quality of yogurt

2.5 最佳工艺条件的验证

由响应面试验的分析可知，回归模型存在最大值，红曲酸奶发酵条件理论值为红曲米添加量4.83%，菌种接种量4.23%，发酵时间5.37h，在此最佳条件下，酸奶感官评分为96.3分。为了检验上述方法的可靠性，考虑到实际操作方便，选取红曲米添加量为4.8%，菌种接种量为4.2%，发酵时间为5.5h，在此条件下进行3组平行试验，最终得到的红曲酸奶感官评分平均值为95.3分，与理论预测值差异不显著，这说明回归方程能够真实地筛选因素对红曲酸奶感官品质的影响，对于红曲酸奶的制作工艺的研究具有指导意义。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken中心组合试验设计，对红曲米添加量、菌种接种量和发酵时间3个因素进行响应曲面分析，结果表明，红曲米添加量、菌种接种量以及发酵时间都会影响红曲酸奶的感官评分（P＜0.05）。综合分析确定的最佳工艺条件为红曲米添加量4.8%，菌种接种量4.2%，发酵时间5.5h，在此条件下，其感官评分平均值为95.3分，与理论预测值拟合程度较好，说明响应曲面法对红曲酸奶工艺条件的优化是可行的。

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Optimization of fermentation process ofMonascusyogurt by response surface methodology

XIAO Changgui,LIU Zhibin,ZHANG Wen,NI Li*
(Institute of Food Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The effective components ofMonascusextracted with ultrasound-assisted method were used for the fermentation of a novelMonascusyogurt.The effect ofMonascusrice addition,inoculum and fermentation time on the sensory quality ofMonascusyogurt were studied by single factor experiment and they were further optimized by central composite design and response surface methodology.Results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:Monascusrice addition 4.8%,inoculum 4.2%and fermentation time 5.5 h.Under the optimal condition,the Monascusrice yogurt had delicate structure,uniform color and moderate sweetness and sourness.The sensory evaluation score was 95.3,which was almost consistent with the predicted data.

ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology;Monascusyogurt;sensory evaluation

TS252.54

B

0254-5071（2014）04-0145-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.035

2014-02-17

国家自然科学基金（313718207）

肖昌贵（1989-），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。*

倪莉（1972-），女，教授，博士，研究方向为食品与生物化学。