CXC趋化因子配体16在慢性肾脏病中的表达及其意义

叶菡洋，金领微，金建，陈琰，高依依，黄文，李占园，郑育，周志宏

（温州医科大学附属第二医院 肾内科，浙江 温州 325027）

·论 著·

CXC趋化因子配体16在慢性肾脏病中的表达及其意义

叶菡洋，金领微，金建，陈琰，高依依，黄文，李占园，郑育，周志宏

（温州医科大学附属第二医院 肾内科，浙江 温州 325027）

目的：观察CXC趋化因子配体16（CXCL16）在慢性肾脏病（CKD）患者和CDK动物模型中的表达情况，研究其与肾功能等因素的相关性，探讨CXCL16在CKD进展中的作用。方法：在临床研究方面，收集200例CKD患者[按肾小球滤过率（eGFR）分为CKD 1-2期组、CKD 3-4期组和CKD 5期组]和40例健康对照组的外周血标本，检测血清肌酐、尿素氮、血脂、eGFR等各项指标，并检测血清中CXCL16的含量。在动物实验方面，取雄性C57BL/6小鼠14只，随机分为普通对照组及普通模型组（各7只），雄性CXCL16基因敲除小鼠7只，随机分为基因敲除对照组（3只）及基因敲除模型组（4只）。4周后处死小鼠，检测小鼠血清尿素氮、肌酐、CXCL16等指标，观察肾组织病理改变。结果：健康对照组和CKD各期组患者之间年龄、性别、体质量指数（BMI）差异无统计学意义（P＞0.05）。CKD 5期组患者血清CXCL16水平高于健康对照组和CKD 1-2期组、CKD 3-4期组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在校正了CKD患者的年龄、性别、BMI后，eGFR、C-反应蛋白（CRP）和脂联素与血浆CXCL-16独立相关。在动物实验中，CXCL基因敲除模型组与普通模型组相比，其血清尿素氮、肌酐及尿酸升高幅度偏低；肾脏病理提示基因敲除模型组小鼠肾脏损伤程度轻于普通模型组。结论：随着CKD的进展，血浆中CXCL-16的水平显著升高，并与肾功能的变化独立相关。

CXC趋化因子配体16；肾疾病，慢性；肾功能不全

CXC趋化因子配体16（CXCL16）是一个跨膜分子，因其具有受体的功能而被命名为磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白（ox-LDL）的清道夫受体，参与炎症和免疫应答过程。作为清道夫受体，CXCL16可以介导巨噬细胞吞噬ox-LDL，形成泡沫细胞，促进动脉粥样硬化的发生。作为趋化因子，它可以参与炎症细胞的趋化及炎症细胞间的相互作用。已有研究证实CXCL16在肾脏组织中有表达，但迄今为止对CXCL16的确切生物活性及其作用机制仍了解甚少。本研究通过观察慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者外周血中CXCL16的表达差异，并构建CKD动物模型，观察在CXCL16基因敲除后其肾脏功能和病理改变，初步探讨CXCL16在CKD中的意义。

1 对象和方法

1.1 临床研究部分

1.1.1 对象：选取2012年1月至2012年12月在温州医科大学附属第二医院肾内科就诊的CKD患者共200例，其中女71例，男129例。肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）根据简化的肾脏病饮食公式（the simplified modification of diet in renal disease formula，MDRD公式）估算，eGFR=175×[肌酐（mg/dL）]-1.234×[年龄（岁）]-0.179×性别（男性=1，女性=0.79）。按照《慢性肾脏病及透析的临床实践指南》（简称为K/DOQI指南）中CKD诊断标准将患者分为CKD 1-2期组、CKD 3-4期组和CKD 5期组。选取我院同期体检的健康成人40例为对照组，其中男26例，女14例，其血常规、尿常规、肝肾功能、血电解质和血脂等均处正常范围。所有受试对象均签署知情同意书。

1.1.2方法：①收集一般资料，如年龄、性别、体质量指数（BMI）以及既往病史。②空腹至少10 h后，取2.5 mL外周血标本分离血清，按0.2 mL等分分装，-80 ℃低温保存。取分离的血样品一份送本院临床检验室，日立7600全自动仪进行各项生化指标检测，以化学试剂法测定。检测指标包括：白蛋白、空腹血糖、血磷、尿素氮、肌酐、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等。③采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清CXCL16、脂联素、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP），检测试剂盒均购于美国R&D公司，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2 动物实验部分

1.2.1 动物：清洁级雄性10周龄C57BL/6小鼠14只，体质量22～24 g，购自北京唯通利华实验动物技术有限公司（动物合格证号：0300740），适应性喂养1周后，随机分为普通对照组和普通模型组，各7只。10周龄雄性CXCL16基因敲除C57BL/6小鼠7只，体质量15～17 g，由温州医科大学药学院赠送，适应性喂养1周后，随机分为基因敲除模型组（n=4）和基因敲除对照组（n=3）。所有动物均饲养于温州医科大学实验动物中心，温度为（23±2）℃，相对湿度为（55±2）%，房间保持通风、安静，定期更换垫料，清洗笼具。参考Yokozawa等[1]实验方法，普通模型组和基因敲除模型组予腺嘌呤混悬液灌胃（第1周和第2～第4周给药剂量分别为250 mg/kg和125 mg/kg，均为每2 d给药1次，上午给药）。普通对照组、基因敲除对照组予等量蒸馏水灌胃。

1.2.2 方法：①观察小鼠给药期间的身体状况及活动情况，每天记录摄食量及体质量变化。②造模4周后处死小鼠，摘除小鼠眼球取血，血标本室温下2 000 r/min离心10 min，然后取上层血清，用日立7600全自动仪以化学试剂法测定其中CXCL16、尿素氮、肌酐、尿酸等指标的含量。③造模4周后解剖小鼠并取出双侧肾脏，经10%甲醛固定、石蜡包埋，切片厚度为3μm，采用HE染色法观察肾组织病理变化。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0进行统计学处理。计量资料采用表示，组间比较根据数据是否正态分布及各组间是否方差齐性分别选用单因素方差分析和非参数检验。率的比较采用卡方检验。相关分析采用pearson相关和逐步回归法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床研究结果

2.1.1 临床资料比较：对照组和CKD各期患者之间年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。CKD各期甘油三酯和血尿酸水平均高于对照组（P＜0.05），血浆白蛋白低于对照组，而CKD各期之间差异无统计学意义（P＞0.05）。CKD 1-4期患者与对照组比较，空腹血糖、脂联素差异均无统计学意义（P＞0.05），CKD各期组血CRP、肌酐、尿素氮明显高于对照组（P＜0.05），且CKD各期之间CRP、肌酐、尿素氮差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组患者一般资料和生化指标的比较（±s）

2.1.2 各组患者血清CXCL16水平的比较：本研究显示男性[（2.20±0.41）ng/mL，n=155]与女性[（2.18±0.53）ng/mL，n=85]之间血清CXCL16水平差异无统计学意义（P=0.93）。CKD 5期组患者血清CXCL16水平显著高于对照组，并高于CKD 1-2期组及CKD 3-4期组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且随着CKD进展，CXCL16水平逐步增加（见表1）。伴2型糖尿病CKD患者（n=68）的血清CXCL16水平为（2.28±0.63）ng/mL，非糖尿病CKD患者（n=132）的血清CXCL16水平为（2.08±0.58）ng/mL，两者间差异有统计学意义（P=0.023）。伴高血压CKD患者（n=92）的血清CXCL16水平为（2.23±0.66）ng/mL，非高血压CKD患者（n=108）的血清CXCL16水平为（2.10±0.63）ng/mL，两者间差异无统计学意义（P=0.138）。血清CXCL16水平在伴冠心病的CKD患者和非冠心病的CKD患者间差异亦无统计学意义（P=0.396）。但是，同时有糖尿病、高血压和冠心病的CKD患者（n=9）血清CXCL16水平为（2.47±0.63）ng/mL，与没有这些伴发病的CKD患者[（2.01±0.36）ng/mL，n=55]相比明显升高（P=0.005）。

2.1.3 血清CXCL16与各临床参数间的相关性：通过年龄、性别、BMI、高血压和糖尿病的校正后，相关分析显示血清CXCL16水平与血尿素氮、肌酐、尿酸、脂联素、CRP呈正相关（分别r=0.255、0.288、0.167、0.375、0.149），与eGFR、高密度脂蛋白呈负相关（分别r=-0.255、-0.172），详见表2。

2.1.4 逐步回归分析 结果：在校正了CKD患者的年龄、性别、BMI后，eGFR、CRP和脂联素与血浆CXCL16独立相关（分别P=0.003，P＜0.001，P=0.033，见表3），而其他参数在分析后均排除了这种相关性。

2.2 动物实验结果

2.2.1 小鼠体质量及血生化指标变化：在实验中我们观察到在同一时间点，相较于普通对照组和基因敲除对照组，普通模型组和基因敲除模型组小鼠稍萎靡，体质量下降，活动量减少；普通模型组及基因敲除模型组小鼠血尿素氮、肌酐及磷较普通对照组明显升高，提示本实验造模成功。基因敲除模型组与普通模型组相比，其血清尿素氮、肌酐及磷升高幅度偏低（见表4）。

2.2.2 各组小鼠CXCL16的表达：与普通对照组相比，普通模型组小鼠的血标本中CXCL16表达明显升高，而在基因敲除模型组及基因敲除对照组中，CXCL16的表达几乎检测不到，见表4。

表2 血浆CXCL16水平与各项指标的相关性

表3 逐步回归分析血浆CXCL16水平与各项指标的独立相关性

2.2.3 各组小鼠肾脏病理光镜下改变：HE染色结果显示，模型组部分肾小球系膜区细胞增生，基质增多，部分肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，肾间质有炎性细胞浸润。基因敲除模型组小鼠肾脏损伤程度比较普通模型组轻（见图1）。

3 讨论

CXCL16是一种表达于树枝状细胞和巨噬细胞的趋化因子，它对T细胞和NK细胞进入各种组织和细胞间的相互作用（通过CXCR-6反受体）起着重要的作用[2]。国内外研究提示CXCL16在动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、心瓣膜病、炎性肝病、肿瘤等疾病进展中发挥作用。目前对CXCL16与肾脏疾病关系的研究主要集中在动物水平，在人体尤其是CKD患者中，有关CXCL16的研究尚少。国外学者通过双色免疫荧光法证实了CXCL16和金属蛋白酶ADAM10在正常人群和肾炎患者的肾组织中均有表达，以肾小球、远曲小管、连接管、集合管的主细胞等部位为主[3]。有研究提示血清CXCL16水平在伴肾病活动性系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中明显高于非肾病活动性SLE患者，并且在狼疮鼠模型的受累肾脏中发现CXCL16的高度表达[4]。也有研究发现，痛风患者CXCL16的表达与肾功能密切相关，在痛风合并CKD患者中，其血浆CXCL16水平显著高于正常对照人群以及单纯CKD患者[5]。

表4 各组小鼠血生化指标变化（±s）

表4 各组小鼠血生化指标变化（±s）

组别nCXCL16（pg/mL）白蛋白（g/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）磷（mmol/L）普通对照组7194.42±49.9014.1±0.913.4±0.522.6±3.52.42±0.2普通模型组7362.80±72.23a12.6±0.5a19.4±1.1a39.6±2.4a3.60±1.2a基因敲除模型组418.50±2.38ab14.0±0.8b17.0±0.8ab30.5±0.6ab3.00±0.2ab基因敲除对照组319.60±1.52ab14.0±1.0b13.0±1.0bc23.6±1.5bc2.30±0.2bcF 50.635.6767.3558.7960.26与普通对照组比：aP＜0.05；与普通模型组比：bP＜0.05；与基因敲除模型组比：cP＜0.05

本组资料显示随着CKD患者的肾功能下降，从早期进展到终末期，血浆CXCL16浓度进行性增高，且CKD患者的CXCL16浓度明显高于健康人群，此结果提示CXCL16在肾病的进展中扮演重要的角色。eGFR、血肌酐和血尿素氮是反映肾功能变化的常用指标，我们的研究提示在所有的CKD患者中，血浆CXCL16的水平与eGFR、肌酐和尿素氮密切相关，这也提示CXCL16与CKD患者的肾功能改变密切相关。但是，目前CXCL16浓度增高与CKD进展相关的具体机制尚未完全清楚。既往动物实验显示单侧输尿管梗阻后，高胆固醇血症和高ox-LDL的产生可引起肾功能损伤，其血浆中CXCL16随肾功能损伤显著增高，而且在肾小球疾病尤其膜性肾病的病理中，CXCL16作为ox-LDL的清道夫受体表达于足细胞[6-7]。我们推测CXCL16随CKD患者疾病进展而增高是由于代谢应激所致，具体机制需要进一步研究。

同时我们的研究显示，在合并有糖尿病的CKD患者的血浆CXCL16水平显著高于非糖尿病CKD患者，血浆CXCL16水平与eGFR、CRP和脂联素水平呈独立正相关，证实了CXCL16在机体炎症介导方面起了积极的作用。

目前CXCL16在CKD患者体内表达增加的意义尚未明确。CXCL16的升高是抵抗肾功能恶化的一种适应性反应，还是在肾功能恶化过程中起着推动作用，是我们接下去要解答的问题。所以我们在实验研究中建立了CKD动物模型，观察CXCL16基因敲除小鼠与普通小鼠的肾脏损害情况。研究发现在普通小鼠CKD模型中，其血浆CXCL16的表达明显增加，同时小鼠出现了明显的肾功能损害及肾脏病理损伤，而在CXCL16基因敲除小鼠的慢性肾病模型中，血浆中的CXCL16几乎未检测到，且肾功能损害及肾脏病理损伤轻于小鼠造模组。因此，我们推测CXCL16在肾脏病变中可能为损伤因子，其高浓度的表达促进肾单位损伤加重。Xia等[8]在CXCL16基因敲除小鼠的研究中发现，CXCL16的炎症趋化作用在肾脏损伤和肾脏纤维化中起到了重要作用。

综上所述，我们的研究结果显示随着肾功能的恶化，CXCL16水平逐渐升高，而CXCL16的高表达可进一步促进肾单位损伤。对CXCL16活性和肾功能下降的病因机制的进一步研究可能为治疗终末期CKD患者提供新的目标。

[1] Yokozawa T, Zheng PD, Oura H, et al. Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rats[J]. Nephron, 1986, 44(3): 230-234.

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[4] Wu T, Xie C, Wang HW, et al. Elevated urinary VCAM-1, P-selectin, soluble TNF receptor-1, and CXC chemokine ligand 16 in multiple murine lupus strains and human lupus nephritis[J]. J Immunol, 2007, 179(10): 7166-7175.

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[7] Schramme A, Abdel-Bakky MS, Gutwein P, et al. Characterization of CXCL16 and ADAM10 in the normal and transplanted kidney[J]. Kidney Int, 2008, 74(3): 328-338.

[8] Xia Y, Entman ML, Wang Y, et al. Critical role of CXCL16 in hypertensive kidney injury and fbrosis[J]. Hypertension, 2013, 62(6): 1129-1137.

（本文编辑：丁敏娇）

Objective:To study the effect of C-X-C chemokine ligand 16 (CXCL16) in patients with chronic kidney disease (CKD) and animal models of nephritic syndrome. To investigate whether elevated CXCL16 concentrations were associated with renal failure in the development of CKD.Methods:Serum samples of 40 healthy people and 200 CKD subjects including our patients and long-term hemodialytic patients were collected. Plasma CXCL16 levels and other clinical and biochemical parameters in all subjects were obtained based on the clinical examinational standard methods. As for experimental animals, 14 male C57BL/6 rats were obtained, which were distributed into common control group and common model group. 7 CXCL16 knockout rats which were randomly distributed into knockout control group and knockout model group were also obtained. Their living conditions were observed for 4 weeks. After that, they were killed and their serum urea nitrogen, creatine, CXCL16 and other indexes were determined; the pathological changes of their kidney tissues were observed.Results:Plasma CXCL16 levels were signifcantly increased with the development of CKD from early-and endstage (P＜0.001 for trend), median circulating CXCL16 level was higher in end-stage CKD patients compared with the early-stage CKD patients and the middle-stage CKD patients. After adjusting for age, gender, and body mass index (BMI), plasma CXCL-16 levels signifcantly associated with renal function and other factors in CKD subjects. Correlative analysis showed the level of CXCL16 was positively associated with serum urea nitrogen, serum creatine, CRP and adiponectin (P＜0.05), and negatively associated with eGFR, HDL-C. In the animal experiments, compared with those in common model group, the increments of serum urea nitrogen, creatine and uric acid in knockout model group were much lower. Renal pathology indicated the level of kidney damage in knockout model group was lower than that in common model group. Conclusion: Plasma CXCL16 levels are signifcantly increased with the development of early-to end-stage CKD and are independently associated withthe loss of renal function. Understanding whether increased CXCL16 is a marker or a potential mechanism of myocardial hypertrophy in CKD requires further study.

CXCL16; kidney disease, chronic; renal failure

R692

A

1000-2138（2014）12-0887-05

2014-04-08

温州市科技计划项目（Y20100221）。

叶菡洋（1979-），女，浙江温州人，主治医师，硕士。

周志宏，主任医师，Email：markzhou@wzhealth.com。

Expression and signifcance of CXCL-16 in chronic kidney disease

YE Hanyang, JIN Lingwei, JIN Jian, CHEN Yan, GAO Yiyi, HUANG Wen, LI Zhanyuan, ZHENG Yu, ZHOU Zhihong. Department of Nephrology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027