C-myc和HIF-1α蛋白在预测巨块型宫颈鳞癌新辅助化疗疗效中的作用

吴均，陈苗苗，周青峰，王颖，朱雪琼

（温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027）

·论 著·

C-myc和HIF-1α蛋白在预测巨块型宫颈鳞癌新辅助化疗疗效中的作用

吴均，陈苗苗，周青峰，王颖，朱雪琼

（温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027）

目的：研究C-myc和低氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白在巨块型宫颈鳞癌新辅助动脉化疗前后的变化以及与化疗疗效的相关性。方法：选取2007年1月-2012年8月在我院因巨块型（Ib2或IIa2期）宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者，共36例，新辅助动脉化疗方案均为顺铂、5-氟尿嘧啶加丝裂霉素的联合化疗。采用Western blot法检测宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的特异性表达。采用免疫组织化学SP法检测宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的细胞定位以及两种蛋白在化疗前后、化疗有效组和无效组中的表达差异。结果：①巨块型宫颈鳞癌新辅助动脉化疗的总有效率为52.7%。②C-myc和HIF-1α蛋白在化疗后宫颈鳞癌组织中的表达均显著低于化疗前（均P＜0.05）。③化疗前C-myc和HIF-1α蛋白的表达明显相关。④化疗前宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达在化疗有效组中均比化疗无效组中高（均P＜0.05）。结论：巨块型宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达可在新辅助动脉化疗前辅助预测化疗疗效。

C-myc；低氧诱导因子1α；宫颈肿瘤；新辅助化疗；疗效

新辅助动脉化疗是在术前或者放疗前使用动脉化疗，缩小巨块型宫颈癌局部的体积，以提高随后的手术切除率，减少淋巴结和血管的微转移[1]。研究表明，新辅助化疗仅对部分巨块型宫颈癌患者有效，而术前新辅助化疗疗效好的宫颈癌患者其预后好[2]。寻找在新辅助化疗前预测宫颈癌对化疗药物疗效的指标，以实现“预见性”的新辅助化疗，防止延误确切的手术或放疗时间，将改善巨块型宫颈癌患者的预后。

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶蛋白家族，分子量约为290 kDa，调控着各种细胞的增殖、细胞周期和糖酵解，在多种恶性肿瘤化疗耐药中起了重要的作用[3-5]。在受mTOR调节的众多下游因子中，Myc家族和低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）与多种恶性肿瘤的发生发展以及化疗耐药的关系尤为密切[6-8]。过度活化的mTOR可以通过低氧诱导因子1α（HIF-1α）所介导的丙酮酸激酶M基因转录或是C-myc所介导的丙酮酸激酶M前体RNA（premRNA）的选择性剪切来上调丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase type M2，PKM2）的表达[9]。

我们在前期工作中发现，宫颈鳞癌组织中mTOR和PKM2的表达在新辅助动脉化疗后明显改变，并且与宫颈鳞癌新辅助动脉化疗疗效相关[10-11]，但是宫颈癌新辅助动脉化疗与mTOR-C-myc-PKM2通路或与mTOR-HIF-1α-PKM2通路抑或两者相关尚鲜见报道。本研究采用免疫印迹（Western blot）和免疫组织化学SP法，检测宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白在化疗前后、化疗有效组和化疗无效组中的表达差异，探讨宫颈鳞癌新辅助化疗相关的信号通路以及化疗前预测化疗疗效的指标，为提高巨块型宫颈癌患者的预后提供新思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取自2007年1月至2012年8月间在我院就诊，并因巨块型宫颈鳞癌（肿瘤直径＞4 cm）行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者，共36例，术前未接受过其他治疗。患者年龄25～62岁，中位年龄44岁。根据国际妇产科联盟妇科肿瘤中的宫颈癌临床分期，36例患者中Ib2期21例，占58.3%；IIa2期15例，占41.7%。本研究经我院伦理委员会批准，治疗前患者均签署知情同意书。

1.2 纳入标准 ①活检病理报告为宫颈鳞状细胞癌；②治疗前由2位妇科主任医师三合诊均诊为Ib2或者IIa2期的宫颈鳞癌；③盆腔MRI检查宫颈病灶直径＞4 cm；④骨髓造血功能无明显受损：血白细胞数、血红蛋白和血小板计数均在正常范围；⑤无明显内科合并症，肝、肾功能和心电图正常；⑥Karnofsky评分≥80分；⑦患者依从性好，治疗前知情同意。

1.3 治疗方法 采用Seldinger技术，行双侧子宫动脉插管灌注化疗加栓塞。化疗方案是以顺铂为主的联合化疗：顺铂50 mg/m2+5-氟尿嘧啶500 mg/m2+丝裂霉素8 mg/m2，单次灌注。根据化疗疗效分别给予1～2个疗程的化疗。纳入本研究的患者均在化疗后14～22 d行宫颈癌根治术。

1.4 化疗疗效判定 化疗后2周时采用影像学检查，并测量病灶的最大直径和最大垂直横径的乘积变化情况。根据实体瘤的化疗疗效评估标准评估疗效[11]，分为化疗有效组和化疗无效组。化疗有效组包括化疗后宫颈局部癌灶完全缓解或部分缓解。而化疗无效组包括化疗后宫颈局部癌灶稳定或进展。

1.5 标本采集 化疗前活检时和手术中切除的宫颈癌组织，甲醛固定，经常规脱水和透明后，石蜡包埋。所取得组织均经苏木素伊红染色，确诊为宫颈鳞癌组织标本。

1.6 试剂和仪器 鼠抗人单克隆C-myc抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗人单克隆HIF-1α抗体购自英国Abcam公司，增强化学发光试剂（ECL）购自美国Pierce公司，鼠抗人单克隆GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG、RIPA蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司，SP-9000过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，GS-800扫描仪购自美国Bio-rad公司。

1.7 Western blot法 RIPA蛋白裂解液提取组织中蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50μg蛋白质于8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯膜上，用300 mA恒流转移目的蛋白（C-myc转移60 min，HIF-1α转移100 min）。用含5%脱脂奶粉和Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液于室温中振荡封闭2 h。分别加入相应一抗（鼠抗人C-myc抗体，稀释度1∶200；鼠抗人HIF-1α，稀释度1∶1 000；鼠抗人GAPDH抗体，稀释度1∶500）。4 ℃摇床过夜后，分别加入相应二抗（用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠，稀释度1∶1 000）；在增强化学发光试剂中反应，显影、定影。胶片由GS-800扫描仪扫描。

1.8 免疫组织化学SP法 按照试剂盒说明书操作，切片脱蜡入水，微波修复后，3% H202阻断过氧化物酶活性，山羊血清室温孵育30 min。加相应一抗（鼠抗人单克隆抗体C-myc、HIF-1α，均为1∶200稀释），4 ℃湿盒孵育过夜。生物素标记二抗孵育30 min，后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育15 min，DAB显色后，苏木素复染，淡氨水返蓝，树脂封片。以PBS代替一抗作阴性对照，C-myc和HIF-1α均用已知有阳性表达的宫颈癌切片作为阳性对照。

C-myc和HIF-1α阳性染色主要表现为细胞浆呈棕黄色。每张切片随机选择10个高倍视野，每个视野观察100个细胞，分别进行阳性细胞百分率及染色强度的评分，将两者的乘积进行比较分析。阳性细胞百分率分为：≤5%计0分，6%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计3分，≥75%计4分；染色强度分为：无着色计0分，浅黄色计1分，浅棕色计2分，深棕色计3分。

1.9 统计学处理方法 用SPSS 19.0统计学软件。采用独立样本的t检验比较化疗有效组和化疗无效组患者的年龄、肿块的大小，采用Fisher确切概率法比较2组患者的临床分期，采用Wilcoxon两样本秩和检验比较病理分化程度。因为C-myc和HIF-1α蛋白表达的部分数据为非正态分布，因此数据采用M（P25～P75）表示，组间数据的比较采用非参数检验。宫颈癌化疗前、后组织中两蛋白表达的变化用配对秩和检验进行分析。而两种蛋白质在化疗前宫颈癌组织中的表达在化疗有效组与化疗无效组之间的差异采用Mann-Whitney U法。化疗前、后宫颈癌组织中两蛋白的相关性采用Spearman相关分析。P＜O．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新辅助动脉化疗的疗效 36例巨块型宫颈癌患者在新辅助动脉化疗后19例为化疗有效，17例为化疗无效，总有效率为52.7%。36例巨块型宫颈鳞癌患者的临床特征，见表1。

表1 宫颈鳞癌患者的临床特征（±s）

表1 宫颈鳞癌患者的临床特征（±s）

组别例数年龄（岁）临床分期病理分化程度肿瘤大小（cm）Ib2IIa2高中低化疗有效组1946±811841324.1±1.2化疗无效组17 44±1010741034.2±1.3

经检验，化疗有效组和化疗无效组患者的年龄、肿块大小、临床分期及病理分化程度差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的特异表达 见图1。

2.3 化疗前、后宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达变化 化疗前宫颈鳞癌组织中均有C-myc蛋白的表达，化疗后有5例宫颈鳞癌组织中未见C-myc蛋白的表达。1例化疗前和4例化疗后宫颈鳞癌组织中未见HIF-1α蛋白的表达外，其余均可见到HIF-1α蛋白的表达。具体两种蛋白在化疗前后的表达变化见表2、图2-3。

图1 宫颈中分化鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的特异表达

表2 化疗前、后宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达M（P25～P75）

图2 宫颈鳞癌组织中C-myc在化疗前、后的表达变化（SP法，×400）

图3 宫颈鳞癌组织中HIF-1α在化疗前、后的表达变化（SP法，×400）

经配对秩和检验，宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白在化疗后的表达均明显下降，低于化疗前（Z值分别为2.796，2.929，P＜0.01）。

2.3 化疗前、后宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白表达的相关性 化疗前宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达呈正相关（rs=0.645，P＜0.01）。化疗后宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达无明显相关（rs=0.304，P＞0.05）。

2.4 化疗有效组和化疗无效组中C-myc和HIF-1α蛋白在化疗前宫颈鳞癌组织中的表达，见表3。

表3 2组C-myc和HIF-1α蛋白在化疗前宫颈鳞癌组织中的表达M（P25～P75）

化疗前宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白在化疗有效组中的表达均显著高于化疗无效组（Z值分别为3.625，4.151，P＜0.01）。

3 讨论

C-myc是原癌基因，在肿瘤的发生和进展中起了很重要的作用。但其表达与化疗疗效的相关性在不同肿瘤中报道不一。在对前列腺癌的研究中，C-myc蛋白的表达与泰素帝的耐药相关[12]。而在对转移性乳腺癌的研究中，发现C-myc扩增的患者对化疗（阿霉素+氟尿嘧啶+环磷酰胺或者甲氨蝶呤+氟尿嘧啶+环磷酰胺）疗效优于无C-myc扩增者[13]。Li等[6]对C-myc在宫颈癌筛查中的作用进行研究，采用荧光原位杂交技术检测宫颈液基细胞中的C-myc基因的扩增，发现宫颈脱落细胞中C-myc基因的过表达用于筛查宫颈癌前病变具有较高的特异性。在最近的研究中，唐金芝等[14]发现，正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变与宫颈癌组间C-myc基因的表达有明显差异，其阳性率随着宫颈组织病理级别的增加而逐渐升高。同时发现42例宫颈上皮内瘤变和30例宫颈癌患者在治疗后，C-myc基因的表达明显下降。Yim等[15]将宫颈鳞癌HeLa细胞株和CaSki细胞株经顺铂处理后，应用双向电泳加质谱技术检测差异表达的蛋白，发现C-myc蛋白的表达在顺铂作用后明显下调，并经Western blot法检测证实。但是，C-myc蛋白的表达与宫颈癌新辅助化疗疗效的相关性尚鲜见报道。

低氧为许多实体瘤的共同特征。HIF-1α为实体瘤低氧的标志，可上调血管形成、肿瘤侵袭和抗凋亡等相关基因的表达，与恶性肿瘤的发生发展、侵袭性及化疗的耐药相关[8，16]。HIF-1α与宫颈癌治疗的研究仅见Ishikawa等[17]1篇报道。通过对38例接受体外照射和低剂量腔内放射治疗的IIIb宫颈鳞癌患者进行研究，Ishikawa等[17]发现HIF-1α的强阳性表达与局部肿瘤的控制率无明显相关性，但与放疗后癌症的复发和远处转移关系密切。Nakamura等[16]发现HIF-1α的表达与胃癌的临床病理特征，包括浸润的深度、淋巴结的转移和肿瘤的分期以及生存期均无相关，但其阳性表达与44例接受新辅助5-氟尿嘧啶化疗的晚期胃癌患者的耐药相关。但是，Nakai等[18]却发现在原发性晚期上皮性卵巢癌中，表达HIF-1α的卵巢癌患者对术后紫杉醇和卡铂的联合化疗的疗效明显优于不表达HIF-1α的卵巢癌患者，提示HIF-1α的表达与术后紫杉醇和卡铂联合化疗的疗效呈正相关。

本研究发现宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达在新辅助动脉化疗后均明显下降，而且化疗前癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达呈正相关。表明以顺铂为基础的联合动脉化疗可能与mTOR-C-myc-PKM2通路及mTOR-HIF-1α-PKM2通路均相关，而且两条通路间可能存在相互促进作用，但是C-myc和HIF-1α蛋白与顺铂等化疗药物敏感性的关系以及信号通路间如何相互促进等尚待体外宫颈癌细胞系及裸鼠宫颈癌移植瘤等实验来进一步明确。本研究还发现，化疗前早期巨块型宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白在化疗有效组中的表达明显高于化疗无效组，提示化疗前宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α的高表达与早期巨块型宫颈鳞癌新辅助动脉化疗的疗效相关。通过检测巨块型宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达可在新辅助动脉化疗前辅助预测化疗疗效，为巨块型宫颈鳞癌术前的“预见性”化疗提供依据。

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（本文编辑：吴健敏）

·消 息·

我校附属第一医院入选全国“三级甲等医院公信力”百强榜单

由健康报社发起的“中国健康服务公信力排行榜”日前发布，我校附属第一医院入选“三级甲等医院公信力”百强榜单。我校党委副书记、附属第一医院院长陈肖鸣入选“中国健康服务业十大风云人物”。

（温宣）

·论 著·

Objective:To study the change of C-myc and HIF-1α protein expression after neoadjuvant intraarterial chemotherapy and explore the role of C-myc and HIF-1α protein in prediction on the response of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy in bulky squamous cervical cancer.Methods:Thirty-six patients with stage Ib2or IIa2squamous cervical cancer who underwent neoadjuvant intra-arterial chemotherapy, combined cisplatin with 5-fuorouracil and mitomycin, and radical hysterectomy between 2007 and 2012 in Wenzhou Medical University were selected. Western blot was used to detect the specifc expression of C-myc and HIF-1α protein. Then, streptavidin peroxidase (SP) immunohistochemical staining was used to detect the cellular localization of C-myc and HIF-1α protein and the difference of the expression of C-myc and HIF-1α protein between before and after neoadjuvant chemotherapy and between chemotherapy-response group and non-response group.Results:①The total effective rate of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy in bulky squamous cervical cancer was 52.7%. ②The expression of C-myc and HIF-1α protein in tumor cells after chemotherapy was significantly lower than that before chemotherapy (P＜0.05). ③There was positive correlation between the expression of C-myc protein and HIF-1α protein before chemotherapy. ④The expression of C-myc and HIF-1α protein in chemotherapy-response group before chemotherapy was significantly higher than that in non-response group (P＜0.05). Conclusion: The expression of C-myc and HIF-1α protein in bulky squamous cervical cancer may be used as a predictor for response to neoadjuvant intra-arterial chemotherapy.

C-myc; HIF-1α; cervical neoplasms; neoadjuvant chemotherapy; response

R737.33

A

1000-2138（2014）12-0859-05

2014-08-19

国家自然科学基金资助项目（30700195）。

吴均（1988-），男，浙江建德人，硕士生。现工作单位：温岭市第一人民医院。

朱雪琼，教授，主任医师，博士生导师，Email：zjwzzxq@163.com。

The role of C-myc and HIF-1α protein in the prediction of the response of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy in bulky squamous cervical cancer

WU Jun, CHENG Miaomiao, ZHOU Qingfeng, WANG Ying, ZHU Xueqiong. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027