山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定

李文杨，刘 远，张晓佩，高承芳，陈鑫珠，董晓宁

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013）

山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定

李文杨，刘 远，张晓佩，高承芳，陈鑫珠，董晓宁

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013）

从福建省不同羊场的山羊颈肩部淋巴结脓肿处分离到5株无荚膜、不形成芽孢的革兰氏阳性球杆菌，该菌在含血清的琼脂培养基上，可生长成直径1～2 mm、干燥、中央凸起、不透明、边缘不整齐、伴有β溶血环的菌落，而在普通培养基上生长不良，在麦康凯琼脂培养基上不能生长。根据其形态学、培养特性、生化特性及致病性试验和动物回归试验结果，判定所分离的5株菌为山羊伪结核棒状杆菌。

山羊；伪结核棒状杆菌；分离；鉴定

伪结核棒状杆菌病是由伪结核棒状杆菌引起的人和多种动物共患的一种接触性慢性细菌性传染病。感染羊以局部淋巴结发生脓肿、干酪样坏死以及消瘦为特征。近年来，该病在散养、环境条件差的养羊场发病率呈上升趋势，严重影响了养羊业的经济效益。其临床症状主要是感染羊头颈部或肩前淋巴结和股前淋巴结出现大小不等的脓肿，触之坚硬或有波动感，随着病程延长，脓肿逐渐增大，最后形成如鸡蛋大小的脓疱，切开脓疱，流出乳白色粘性液体甚至干酪样脓汁。病羊常因患处肿胀发痒而在围墙或栏杆上摩擦，而引起脓疱破溃，影响采食和休息，感染严重时表现为咳嗽、食欲下降、体重减轻，脓肿破溃后若波及内脏可引起死亡。伪结核棒状杆菌感染病羊常规外科手术处理易复发，药物治疗效果不显著。为了研究该病，对山羊的典型病例进行了病原菌的分离与鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料及病料

1.1.1 病料采集 从福建省福清、仙游、福安、尤溪和建阳等地羊场的山羊耳下、肩前及膝前淋巴结脓肿处，局部剪毛、消毒，然后用灭菌注射器从脓疱中采集脓汁，置于灭菌试管内进行病原菌的分离培养。

1.1.2 培养基 普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、牛血清马丁肉汤和全血琼脂平板等培养基均由本所实验室配制。

1.1.3 微量发酵管 葡萄糖、阿拉伯糖、山梨酸、棉子糖、鼠李糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐等微量生化培养管均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 药敏纸片 头孢噻肟钠、庆大霉素、环丙沙星、恩洛沙星、青霉素、链霉素、呋喃妥因、硫酸新霉素、氟哌酸、氧氟沙星等药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.5 试验动物 试验用1.5 kg左右家兔和6月龄左右山羊均购自非免疫伪结核棒状杆菌疫苗的健康养殖场。

1.2 实验室检查

1.2.1 染色镜检 取一定量的脓汁用生理盐水作适当稀释后直接涂片，用革兰氏染色法染色镜检。

1.2.2 细菌的分离培养 将无菌采集的脓汁分别接种于普通琼脂平板、10%犊牛血清琼脂平板和麦康凯平板上，置37℃恒温箱培养，然后挑取单个优势菌落接种于普通肉汤、10%犊牛血清肉汤及琼脂平板上进行纯培养，并涂片镜检。

1.2.3 生化试验 取上述纯培养物，按常规方法接种于生化试验培养基中培养24～48 h后观察结果。

1.2.4 药敏试验 用常规纸片法对上述分离菌进行药敏试验。

1.3 动物试验

1.3.1 对兔的致病性试验 取血清肉汤48 h纯培养物以腹腔注射2.0 mL接种于3只肉兔，另设3只对照。每日观察肉兔发病情况并记录。

1.3.2 动物回归试验 取血清肉汤48 h纯培养物以颈部皮下注射2.0 mL接种于2只肉羊，另设2只对照。每日观察肉羊发病情况并记录。

2 结果

2.1 染色镜检

经革兰氏染色镜检可见大量棒状或球杆状、菌落为

细小颗粒样、不透明、边缘不整齐、淡白色的革兰氏阳性菌，无芽孢、鞭毛及荚膜，散在或呈“V”字型排列。

2.2 细菌的分离培养

血清琼脂平板上经37℃、18～24 h的培养，可见菌落白色，干燥、凸起、半透明，直径1～2 mm，随培养时间延长菌落变为不透明，呈乳白色。菌落表现松软、易碎、易推动，很难挑起，菌落周围具有狭窄的β溶血环。普通琼脂平板上生长贫瘠，而在麦康凯平板上未见细菌生长。

普通肉汤和血清肉汤在37℃培养24 h后可见轻度浑浊，血清肉汤混浊更明显，且有白色菌膜出现。在37℃培养48 h后血清肉汤上部逐渐变清，管底有颗粒样沉淀生成，菌膜进一步增厚。

2.3 生化试验

结果见表1。

表1 5株分离菌株生化试验结果

2.4 药敏试验

5株分离菌药敏试验结果基本一致，各药敏纸片的抑菌圈直径分别为头孢噻肟钠32 mm、硫酸新霉素30 mm（高敏），环丙沙星16 mm、氟苯尼考15 mm（中度敏感），红霉素5 mm（低敏），而妥布霉素、四环素、氧氟沙星、恩洛沙星、哌拉西林、利高霉素、庆大霉素、利福平、氟哌酸、青霉素G、链霉素、磺胺类和呋喃妥因均无抑制圈。

2.5 动物试验

接种血清肉汤纯培养物的肉兔，80～116 h内陆续死亡，剖检后可见肝脏、肺脏及肾脏表面有直径1～3 mm白色稍凸起的结核样病变，挑破后有脓汁流出；接种部位出现化脓灶，后期切开见有白色牙膏样脓汁。

人工感染山羊在15 d内未见明显临床症状，但其采食明显减少。在第16～18天，接种部位及周边的浅表淋巴结出现脓肿，脓肿表面有厚而致密的炎性纤维素性肉芽肿性包囊，触摸坚硬，随着时间推移肿块变大，与周围组织界限变得分明，大小如核桃或鸡蛋大；在第23～25天时部分脓肿破溃，流出黄白色无臭无味的黏稠液体，似干酪样，并将脓汁取出培养后分离到与原攻击菌相同的细菌［1］。

3 小结与讨论

1）根据流行病学调查、临床症状、病理变化以及分离菌形态、培养特性、生化特性、动物试验与《伯杰细菌鉴定手册》描述的伪结核棒状杆菌特征基本一致，可判定从发病羊场不同山羊分离的5菌株均为伪结核棒状杆菌［2］。

2）羊伪结核棒状杆菌主要引起绵羊、山羊发生以干酪样淋巴结炎为特征的慢性传染病。美国、澳大利亚及日本等国家或地区均有该病发生。临床上该病发展缓慢，在感染初期不易察觉，容易被人们忽视，但由于伪结核棒状杆菌可产生坏死性、溶血性外毒素，严重影响患病羊的生长发育。因此，早期发现极为重要。李国平在2004年从上海引进的波尔山羊中首次分离出羊伪结核棒状杆菌，证明该菌在福建省存在，近年来有扩大趋势［3］。

3）伪结核棒状杆菌主要通过山羊皮肤创口、粘膜或注射等途径侵入羊体内，除在感染部位形成局灶性脓肿外，还会顺着淋巴管侵入淋巴结引起淋巴结肿大化脓，若感染部位较深或羊体抵抗力较差时，该菌还会经淋巴和血管侵入体内的淋巴结和内脏，虽然病死率不高，但严重影响患羊的健康。由于伪结核棒状杆菌引起的山羊皮下、淋巴脓肿病病灶在形成过程中，表面会形成一层厚而致密的纤维性肉芽肿性包囊，诸多药物都难以通过这层包囊渗入其内，使药物不能均匀地扩散于整个脓肿腔，给治疗造成一定难度，因此在生产上需要寻求一种快速有效的治疗方法。

4）在养羊生产中，由于绝大多数养羊户仅注重一些危害严重疫病的防治，而忽视诸如伪结核棒杆菌病等危害相对较小疫病的防治。虽然伪结核棒杆菌引起的发病率较高，而致死率较低，常被人们忽视，但它却又是世界公认的难以防治的传染病之一，一旦侵入羊群则很难彻底清除，给养羊业的发展造成较大危害，应引起广大养殖户的高度重视［4］。目前本病还没有供临床使用的疫苗，应搞好环境消毒，以预防为主，防止外伤发生是预防本病的关键。

［1］王志芳，杨增岐，宋志军，等.羊伪结核病病原的分离鉴定［J］.中国预防兽医学报，2004，26（5）：365-367．

［2］R E布坎南.伯杰细菌鉴定手册［M］.8版.中国科学院微生物研究所，译.北京：科学出版社，1984：833-844.

［3］李国平，陈家祥，王全溪.波尔山羊伪结核棒状杆菌在我省的首次分离鉴定［J］.福建畜牧兽医，2003，25（5）：1-2.

［4］王韡，张彦明，邢福珊，等.羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及ELISA检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2005，25（1）：34-36.

S858.27

A

2095-3887（2014）05-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.015

2014-07-14

李文杨（1972-），男，副研究员，硕士，主要从事草食动物研究。