一种羊酸奶发酵剂的富硒工艺研究

张海涛，牛 林，淡瑞芳（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

一种羊酸奶发酵剂的富硒工艺研究

张海涛，牛 林，淡瑞芳*
（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

以菌体中含硒量为指标，确定加硒和富硒培养时间、培养温度、菌种接种比例，采用正交实验对加硒浓度、接种量、培养pH和低聚果糖添加量4个较为重要的富硒因素进行优化。结果表明：单因素实验确定加硒时间为菌体培养开始后24h，富硒培养时间60h，培养温度41℃，长双歧杆菌与嗜酸乳杆菌按2∶1混合培养。以菌体含硒量为考察指标，获得最佳发酵条件为：混合菌接种量3%，硒的质量浓度8μg/g，低聚果糖质量浓度1.00%，pH6.5，此时酸奶发酵剂中硒含量约33.46μg/kg。

羊酸奶，发酵，富硒条件，优化

硒（selenium）是人体所必需的微量元素[1]，它对人体的正常代谢起着重要的调节作用。缺硒可能导致癌症和心肌梗塞等多种疾病的发生，通过膳食摄取足够的硒，可起到预防有关疾病的作用[2-3]。中国营养学会推荐正常人体硒摄入量为60～200μg/d。根据我国13省市营养调查报告结果，调查区域内普遍存在硒摄入量不足的问题，成人每日人均硒摄入量仅为26.36μg[4]。按照形态分类，硒可分为有机硒和无机硒两种，但无机硒毒性高，而有机硒具有吸收利用率高并且且副作用小的优点，所以硒的生物转化是一条安全有效的途径[5]。研究表明乳酸菌具有优良的富硒能力[6-7]，是一种有机硒的良好来源。随着硒对人体的功效认识的逐渐深入，开发富硒产品已引起各方面的重视，特别是开发富硒保健食品，针对各种由于缺硒而带来的疾病预防具有非凡的意义。

羊奶富含蛋白质、乳糖、脂肪、多种维生素和矿物质元素，具有多种保健功能、易于吸收，是世界上公认的最接近人奶的奶品，也是现代人类健康的“营养佳品”[8]，但羊奶硒含量低于牛奶，因此，利用羊奶开发富硒酸奶，可以更好发挥羊乳的保健功能，推进羊乳产业的发展，起到积极的作用。本文以长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌作为发酵菌种，通过单因素实验依次考察影响菌体含硒量的各个因素，选取较优的水平进行正交实验，以硒含量为考察指标确定出富硒羊酸奶的主要发酵剂生产工艺，以期为富硒羊酸奶的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长双歧杆菌lb05 上海信然生物技术有限公司；嗜酸乳杆菌sl05 江苏沃尔德实业有限公司；蛋白胨（生化试剂） 湖北辉华生物有限公司；牛肉浸粉（生化试剂） 上海科兴生化试剂有限公司；酵母浸膏（生化试剂） 宜兴市江山生物制剂有限公司；亚硒酸钠（食品级） 郑州锦德化工有限公司。

NDJ-7粘度计 深圳市恒盛丰工贸有限公司；Forma1029厌氧培养系统 北京晨时科仪商贸有限公司；SKD-600自动凯氏定氮仪 南京创睿仪器仪表有限公司；DNP-9082恒温培养箱 常州市伟嘉仪器制造有限公司；PHS-3cpH仪 深圳市卡迪亚科技有限公司；KXX-5-12马弗炉 上虞市鑫达实验设备厂；FD-IB-50冷冻干燥机 台湾台大电子（东莞）有限公司；MARK MW3系列电子天平 铂悦仪器（上海）有限公司；DZF-6021真空干燥箱 上海杰伟福电子商务有限公司；SW-CJ-1F双面净化工作台 上海康路仪器设备有限公司；MWCO3500透析袋 上海源叶生物科技有限公司；罗兹哥特里抽脂瓶 北京朋利驰科技有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 液体MRS培养基 蛋白陈10g、牛肉浸粉8g、酵母浸膏9g、葡萄糖20g、KH2PO 2g、柠檬酸氢二铵2g、CH3COONa 5g、MgSO40.2g、MnSO40.04g、Tween 80mL、蒸馏水1000mL，pH为5.7±0.2，121℃灭菌20min；液体MRS改良培养基：于MRS液体培养基中添加0.05%半胱氨酸盐酸盐121℃灭菌20min；固体MRS培养基 于MRS液体培养基中添加14g的琼脂，121℃灭菌20min；MRS-raffinose：在MRS固体培养基中添加1%的棉籽糖、0.05%半胱氨酸盐酸盐和0.05% LiCl于121℃灭菌20min；全脂羊乳培养基 复原羊乳92%、蔗糖6%、低聚异麦芽糖1%、酪蛋白酸钠1%、Na2SeO340μg/kg，108℃灭菌20min。

1.2.2 混合菌体富硒培养方法 配制一定浓度亚硒酸钠溶液，灭菌待用。在无菌操作条件下，按照一定比例将亚硒酸钠溶液加至改良液体MRS培养基中，摇匀，接入长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05。在37℃下培养72h，然后将混合菌体培养物在4℃，10000r/min条件下，离心10min，弃上清液，用去离子水洗涤3次，置于真空干燥箱中干燥（50℃，-0.1MPa）至恒重，得混合菌体。

1.2.3 菌体有机硒含量的测定 取1g富硒发酵剂加入截留分子质量为3500u透析袋中，并置于去离子水中透析至无硒析出时，说明无机硒已经全部析出，再将其在4℃，10000r/min条件下，离心10min，弃上清液用去离子水洗涤3次，60℃干燥至恒重，然后参考石墨炉原子吸收法测定[9]，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 益生菌富硒条件的单因素实验

1.2.4.1 不同硒浓度对菌体富硒效果的影响 配制硒酸钠含量分别为2、4、6、8、10μg/g培养基，测定lb05、sl05纯菌种和lb05∶sl05为1∶1混合菌种在37℃条件下，发酵50h后的菌体硒含量。

1.2.4.2 加硒时间对菌体富硒效果的影响 采用lb05∶sl05为1∶1混合菌种，分别在0、4、8、12、16、20、24、28、32h添加亚硒酸钠溶液，调节培养基硒含量为6μg/g，测定在37℃条件下，发酵50h后的菌体硒含量。

1.2.4.3 培养时间对菌体富硒效果的影响 采用lb05∶sl05为1∶1混合菌种，发酵6h后，调节培养基硒含量为6μg/g，分别培养36、48、60、72、84h后，测定菌体硒含量。

1.2.4.4 发酵温度和初始pH对菌体含硒量的影响 调节培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0，分别在33、35、37、39、41、43℃的培养温度培养60h，测定菌体硒含量。1.2.4.5 接种比例和接种量对菌体含硒量的影响 按照长双歧杆菌：嗜酸乳杆菌=1∶1、2∶1、3∶1、2∶3、1∶2比例进行对菌种进行复配，调节培养基pH为6.0，按照体积分数的1%、2%、3%、4%、5%接种，在41℃条件下培养60h，测定菌体硒含量。

1.2.4.6 低聚糖及其含量对菌体含硒量的影响 液体改良MRS培养基中等量的葡萄糖分别按照0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的比例以低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚异麦芽糖代替，调节培养基pH为6.0，添加复合菌种（lb05∶sl05=2∶1）3%，在41℃条件下培养60h，测定菌体硒含量。

1.2.5 正交实验优化益生菌的富硒条件 在单因素实验结果基础上，选取接种量、硒浓度、pH及低聚果糖添加量进行四因素三水平正交实验，因素水平表见表1，制作发酵羊酸奶发酵剂，以羊酸奶发酵剂中硒含量作为考察指标。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test factors L9（34）

1.2.6 液态及固态富硒羊酸奶发酵剂的制备 收集长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05混合富硒培养产物，将其置于50mL无菌离心管内，10000r/min，4℃冷冻离心10min。取一定量的预先经过108℃灭菌20min的10%脱脂复原羊乳，冲洗菌体并稀释至约4×108cfu/mL浓度，制备得液态富硒羊酸奶发酵剂。制备所得液态发酵剂置于-80℃低温冰箱内预冻2h，以冷冻温度-50℃，真空度20Pa，真空冷冻干燥约48h，即得固态富硒羊酸奶发酵剂。

2 结果与分析

2.1 硒浓度对菌体含硒量的影响

不同硒浓度对菌体含硒量的影响如图1所示，硒浓度在2～10μg/g范围内，长双歧杆菌lb05、嗜酸乳杆菌sl05及其混合（1∶1）菌体中含硒量均先上升，后增加不显著，其中混合菌种富硒效果显著，在加硒浓度为6μg/g时，混合菌种富硒效果最佳，菌体含硒量为532μg/g，含量最高。因此，选择以长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05按1∶1的混合比例培养富硒。在后续的正交实验中以6μg/g为中间值进一步优化最适的硒浓度值。

2.2 加硒时间对菌体含硒量的影响

加硒时间对菌体含硒量的影响如图2所示，长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05混合富硒培养后24h时加硒，菌体中含硒量达最高值488μg/g，这是由于生长阶段不同，微生物对硒的吸收利用率也不同[8]。实验结果表明培养至24h加硒效果最理想，实验所用菌株种类不同，菌株的性质决定了在菌株的不同生长阶段转化的硒能力有差别，所以加硒时间有先后差异。

图1 不同硒质量浓度对菌体含硒量的影响Fig.1 Content of selenium in cells with different concentration of the selenium

图2 不同加硒时间下菌体含硒量Fig.2 Content of selenium in cells in different selenium-added time

2.3 培养时间对菌体含硒量的影响

不同培养时间下菌体含硒量影响如图3所示，长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05混合培养36～60h时，菌体含硒量呈上升趋势，而在60～84h范围内，菌体中含硒量呈下降趋势。因此，适宜的培养时间为60h。

图3 不同培养时间下菌体含硒量Fig.3 Different cell culture time selenium content

2.4 发酵温度和初始pH对菌体含硒量的影响

发酵温度和初始pH对菌体含硒量的影响如图4所示，在37～41℃范围内，菌体含硒量随温度上升而增加，而大于41℃时呈下降趋势。此外，pH为6.0时，菌体中硒含量（518μg/g）明显高于pH5.0和pH7.0时的硒含量（分别为498μg/g和486μg/g）。因此，选择适宜的富硒培养温度为41℃，pH为6，并在后面的正交实验中以6.0为中间值进一步优化最适发酵pH。

图4 不同温度和pH下菌体含硒量Fig.4 Content of celenium in cells under different innital pH and culture temperature

2.5 接种比例和接种量对菌体含硒量的影响

接种比例和接种量对菌体含硒量的影响如图5所示，当接种量从1%升至3%时，不同混合比例的菌体含硒量随接种量增加而呈上升趋势。而从3%进一步升到5%时，接种比（菌株lb05∶sl05）为1∶1、2∶1、2∶3和1∶2的菌体含硒量增加量均不显著，所有组别中的高峰值出现在接种量为3%时，其中接种比例为2∶1时，此时菌体含硒量达到548μg/g，次高峰值为同组的1∶1比例混合样，菌体含硒量为530μg/g。因此，确定长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05混合比例为2∶1，并在后续的正交实验中以3%接种比例为中间值进一步优化最佳的接种量。

图5 不同接种比例与接种量下菌体含硒量Fig.5 Content of selenium in cells with different inoculation ratio and amount

2.6 低聚糖及其含量对菌体含硒量的影响

低聚糖及其含量对菌体含硒量的影响如图6所示，添加低聚糖能不同程度地促进两种乳酸菌的富硒能力。其中以低聚果糖的作用最为显著，在其添加量为1%时，菌体含硒量可高达530μg/g。作为乳酸菌生长过程中主要的“食物来源”（即通常所称的“益生元”），低聚果糖、木糖、异麦芽糖等因为分子结构上的差异，使得这些益生菌在将其分解，获取能量上的效率不同，生长速度上也不同，导致最终的菌体含硒量出现较大差距[12]。在后续的正交实验中，将以1%作为中间值，进一步研究低聚果糖的最优添加量。

图6 不同低聚糖及其含量下的菌体含硒量Fig.6 Content of selenium in cells with different oligo and content

2.7 羊酸奶发酵剂富硒条件优化正交实验

依据单因素实验结果，重点选取接种量、硒浓度、pH及低聚果糖添加量进行四因素三水平正交实验。制作羊酸奶发酵剂，以羊酸奶发酵剂中的含硒量作为考察指标，结果见表2。由表2可知，当以“羊酸奶发酵剂含硒量”作为考察指标时，最佳的水平组合为A2B3C3D2。即混合菌接种量3%，硒的质量浓度8μg/g，pH6.5，低聚果糖质量浓度1%。按照优化后的条件进行验证实验，3次实验酸奶发酵剂中平均硒含量为33.46μg/g。

表2 接种量、硒浓度、pH及低聚果糖正交实验结果Table 2 Inoculation,selenium concentration，pH and oligofructose orthogonal test results

3 结论

通过研究了加硒浓度、加硒时间、发酵时间、发酵温度、发酵初始pH、接种量、各菌株混合比例、添加的低聚糖种类和浓度等工艺条件对羊酸奶中含硒量的影响。在单因素实验基础上，采用正交实验设计对酸奶发酵工艺进行优化，获得最佳发酵条件为：混合菌接种量3%，硒的质量浓度8μg/g，pH6.5，低聚果糖质量浓度1%。此时酸奶发酵剂中硒含量约33.46μg/kg。说明长双歧杆菌lb05和嗜酸乳杆菌sl05具有良好地富硒能力，发酵的羊酸奶能很好的补充人体硒元素，为富硒羊酸奶发酵的工业化生产提供可靠的理论依据。

[1]赵美松，毛礼钟.硒的重要生理功能[J].生物学通报，1996，31（6）：15-16.

[2]Finley J W，Davis C D，Feng Y.Selenium from high selenium broccoli protects rats from colon cancer[J].J Nutr，2000，130（9）：2384-2389.

[3]Wright G S，Gruidl M E.Early detection and prevention of lungcancer[J].Curr Opin Oncology，2000，12（2）：143-148.

[4]铁梅.食用菌中硒的形态分析[D].上海：华东师范大学，2006.

[5]Ip C，Birringer M，Block E，et al.Chemical speciation influences comparative activity of selenium-enriched garlicand yeast in mammary cancer prevention[J].J Agr Food Chem，2000，48（6）：2062-2070.

[6]Tabasco R，Paarup T，Janer C，et al.Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，L.acidophilus，L. paracaseisubsp paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk[J].International Dairy Journal，2007，17（9）：1107-1114.

[7]Snchez-segarra P J，Garca-martnez M，Gordillooterom J，et al.Influence of the addition of fruit on the mineral content of yoghurts：nutritional assessment[J].Food Chemistry，2000，71（1）：85-89.

[8]牛林，钟芳，李珗，等.不同稳定剂对大果粒酸羊奶品质的影响[J].安徽农业科学，2012，40（25）：12649-12652.

[9]黄高明.石墨炉原子吸收法测定富硒酸奶中有机硒[J].中国酿造，2009（5）：161-164.

[10]中华人民共和国卫生部.GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳[S].北京：中国标准出版社，2010.

Study on the fermentation condition of Goat yogurt for selenium-enriched

ZHANG Hai-tao，NIU Lin，DAN Rui-fang*
（Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China）

The impact of the different fermentation conditions was studied on selenium-enriched of the fermentated goat yogurtionthrough single factor screening and orthogonal experimental.The temperature，culture time of selenium-enriched，incubation temperature and the proportion of inoculation was determined by using selenium content in the bacteria as the index.The fourimportant factors including selenium concentration，inoculum size，culture pH and the added amount of oligofruc to selenium were optimized through orthogonal test.The results showed that the single-factor test to selenium was riched after 24 hours of bacteria cultivation，incubated for 60h at 41℃ with ratio of Bifidobacterium longum，Lactobacillus acidophilus 2∶1 mixed culture through single-factor test.The orthogonal test was done according to the selenium content as the index.The best fermentation conditions were as follow：mixed inoculum of 3%，selenium concentration of 8μg/g，pH6.5，and 1.00%fructo-oligosaccharides by selenium content in yogurt as the main index.The selenium content of goat yogurtion was 33.46μg/kg.

Goat yogurt；fermentation；selenium-enriched；optimization

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.041

2013-09-13 *通讯联系人

张海涛（1974-），男，硕士研究生，副教授，研究方向：农产品加工与贮藏。