响应曲面分析法优化香菇多糖铁(Ⅲ)配合工艺研究
2014-02-25任广明陈志新
任广明,郭 兴,陈志新
(1.黑龙江省伊春林业科学院,黑龙江伊春153000;2.东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨150030)
响应曲面分析法优化香菇多糖铁(Ⅲ)配合工艺研究
任广明1,2,郭 兴1,陈志新1
(1.黑龙江省伊春林业科学院,黑龙江伊春153000;2.东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨150030)
在单因素基础上,以铁结合率为评价指标,采用Box-Behnken Design设计原理,分析香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH和温度对香菇多糖铁(Ⅲ)结合率的影响,建立相应的预测模型。最佳优化工艺为香菇多糖与柠檬酸三钠质量比为1.8,pH为8.0,温度为68.7℃,铁结合率为11.69%。验证结果表明,响应曲面法所优化出的配合工艺合理、有效、具有可行性。
香菇多糖,香菇多糖铁(Ⅲ),响应曲面法
铁是人体内必需的微量元素之一,由于铁缺乏引起的缺铁性贫血(IDA)已经成为世界上最常见营养性疾病之一,威胁着人类的健康[1]。临床上一直选用硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁等无机铁和小分子有机酸铁盐作为补铁剂,其二价铁离子易产生内源性自由基,导致细胞膜脂质过氧化进而造成机体损伤[2],具有明显的副作用。
香菇多糖(lentinan,LNT)是香菇中主要的生物活性成分,具有广泛的药理活性,如抑制肿瘤的发生、发展与转移,调节免疫功能,并能增强体液免疫和细胞免疫功能,降血脂和抗衰老等作用[3-5]。香菇多糖与其他抗肿瘤、抗病毒的药物相比,具有疗效高、毒副作用小等优点。香菇多糖与铁配合生成多糖铁配合物(Polysaccharide-Iron Complex,PIC)已经成为研究的热点,是目前可以应用于临床中的一种较强的免疫增强剂[6]。当配合物释放铁的同时,配体多糖的生物活性成分也可被机体吸收,从而发挥相应的生理效应。可见,多糖铁配合物将成为一种具有广阔发展空间的补铁剂。
响应曲面法是一种多元分析方法,已经广泛应用于食品、化工等领域的物质配比、工艺条件等优化研究[7-12],该方法能够建立连续变量曲面模型,针对影响效应值的各因子水平及其交互作用进行优化与评价[13]。本研究以铁结合率为评价指标,分析了香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH、时间和温度对香菇粗多糖铁(Ⅲ)配合效率的影响。采用Box-Behnken设计,设计17组配合实验,建立连续变量曲面模型。通过数据分析确定了香菇多糖铁(Ⅲ)最佳配合工艺,为香菇多糖及补铁剂的开发与利用提供了相关的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
9608香菇菌株 由黑龙江省伊春林业科学院保藏;葡萄糖、氢氧化钠、三氯化铁、无水乙醇、丙酮、碳酸钠、柠檬酸三钠、氯仿、正丁醇、盐酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等 均为分析纯;铁标准液1000mg/L,北京神州科创生物科技有限公司。
BAO-35A精密鼓风干燥箱 施都凯仪器设备(上海)有限公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂;HZ-2111KB立式振荡培养箱 金坛市盛蓝仪器制造有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;AA-6800原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 香菇多糖的制备
将香菇菌株接种于CYM培养基中,28℃恒温培养,摇床转速为150r/min。通过摇床培养获得大量香菇菌丝体,过滤后于60℃恒温干燥箱中烘干。将烘干后的香菇菌丝体用适量的水置于85℃水浴锅中浸提5h,调节提取液的pH为7.0,离心得上清液。采用旋转蒸发仪减压浓缩上清液后,量取3倍体积的75%乙醇溶液沉淀浓缩液中的多糖,4℃静置过夜后倾去醇沉多糖的上清液,3000r/min离心10min后分级沉淀法纯化粗香菇多糖,真空干燥[14-15]。将干燥的香菇多糖粗品溶于水,扎袋流水透析除盐后,透析液减压浓缩,醇析、离心、真空干燥后得精制香菇多糖。采用硫酸蒽酮比色法,以葡萄糖作为标准液测定香菇多糖的糖含量[16]。
式中:m1为真空干燥后香菇多糖量,g;m2为食用菌菌丝体的干重,g。
1.3 香菇多糖铁(Ⅲ)配合实验
称取一定质量比的香菇多糖与柠檬酸三钠,将其溶于50mL去离子水中,在恒温水浴中不断搅拌10min,缓慢均匀滴加2mol/L FeCl3溶液和20%的NaOH溶液。控制反应液的pH。反应中刚滴入的FeCl3溶液开始形成沉淀,随后沉淀逐渐溶解,当反应中产生的沉淀不再溶解时,表明反应系统的络合能力达到饱和,停止滴加FeCl3溶液和NaOH溶液。继续在恒温水浴中搅拌2.0h,反应冷却后离心、醇析、醇沉,真空干燥。将干燥后的香菇多糖铁(Ⅲ)粗品溶于水中,扎袋流水透析除盐,最终制得香菇多糖铁(Ⅲ)(lentinan-Iron(Ⅲ)complex)配合物[17-19]。
1.4 香菇多糖铁(Ⅲ)配合物的单因素实验
针对香菇多糖铁(Ⅲ)配合物制备设计单因素试验,使香菇多糖与柠檬酸三钠质量比分别为0、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0,恒温水浴温度水平为40、50、60、70、80、90℃,反应液的pH分别控制在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。当反应系统的络合能力达到饱和后恒温水浴搅拌时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h,其中试验固定因子水平:香菇多糖与柠檬酸三钠质量比1.0、恒温水浴温度60℃,pH7.0,搅拌时间为2h。
1.5 响应曲面法优化实验
根据Box-Behnken Design(BBD)组合设计原理,选取香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH和温度3个因素作为自变量,香菇多糖铁结合率(R)为响应值,设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验,其因素水平设计见表1。
表1 响应曲面优化设计编码及水平表Table.1 Codes and Levels of RSM
1.6 香菇多糖铁(Ⅲ)配合物中铁含量测定
铁标准曲线的配制:将铁标准溶液分别配制成浓度为1、2、3、4、5mg·L-1的铁溶液,通过原子吸收分光光度计的测定后,绘制标准曲线,利用该标准曲线校正仪器误差。
准确称取100mg香菇多糖铁(Ⅲ),加入10mL混合酸(HNO3∶HClO4,4∶1)置于电热板上(130℃)加热消化,消化液变成无色透明后,加水反复赶酸,冷却后蒸馏水定容至25mL量瓶中原子吸收分光光度法测定Fe3+浓度[19]。原子吸收分光光度计法测定参数:灯电流6.0mA,狭缝宽0.5nm,波长248.3nm,燃烧器高度6mm,空气流量6.5L/min,乙炔流量1.5L/min。
1.7 数据处理
使用统计分析软件Design Expert V8对BBD设计实验的结果进行分析,拟合二次多项式方程并绘制响应曲面图,并确立香菇多糖铁(Ⅲ)最佳配制工艺。
2 结果与讨论
2.1 香菇多糖含量的测定
9608香菇菌株接种于300mL CYM培养基中,获得干菌丝体2.04g,热水煮沸法提取香菇多糖,香菇多糖经分级沉淀法纯化透析后得精多糖0.36g,提取率为17%。采用蒽酮硫酸法测定香菇多糖中的可溶性多糖的含量,620nm波长下紫外分光光度计检测。葡萄糖标准曲线回归方程为Y=0.7534X+0.0432(R2= 0.9933),通过计算得该品种可溶性总多糖含量为39.92%。
2.2 香菇多糖铁(Ⅲ)配合的单因素实验
2.2.1 香菇多糖与柠檬酸三钠质量比对铁结合率的影响 在香菇多糖铁(Ⅲ)配合反应中,Fe3+首先通过O桥或O-H桥聚合形成聚合铁核,聚合铁核微粒表面可以结合香菇多糖从而形成络合物[20-21]。Spiro和Saltman认为将柠檬酸盐添加到pH高于4时的反应溶液中,柠檬酸盐有助于Fe3+聚合形成聚合铁核,进而使聚合铁核微粒表面结合亲水性配体,产生“增溶”的效应[22]。香菇多糖分子含有羟基、羧基、烷基等亲核能力较强的供电子基团,易与金属离子配合,当香菇多糖与柠檬酸三钠质量比不断增大时,在柠檬酸三钠的催化下这些供电子基团的金属离子结合位点逐渐达到饱和,即随着香菇多糖与柠檬酸三钠质量比的增大铁结合率不断增大,当质量比为大于1.5后开始下降。从图1中可以看出,香菇多糖与柠檬酸三钠质量比为1.5时铁结合率最高为10.57%。
图1 香菇多糖与柠檬酸三钠质量比对铁结合率的影响Fig.1 Effect of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate on the rate of iron combination
2.2.2 反应液pH对铁结合率的影响 由于柠檬酸三钠在pH高于4时发挥其催化作用,因此实验设计的pH依次为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。从图2中可以看出,铁结合率随着pH的升高而增大。反应液pH4.0时铁结合率为5.92%,当pH增大到8.0时铁结合率为10.63%,反应液pH9.0时铁结合率降低了0.2%。从图2中可知,香菇多糖配合铁实验中pH过大,反应液中离子强度增强,产生的阴离子与多糖分子的活性基团发生竞争作用进而阻碍配合物的形成,当pH偏低时,反应液中生成的氢离子增多,导致铁离子配合不完全。糖分子中C2、C3、C6位上的-OH均具有较强的反应活性,是铁(Ⅲ)配合的主要位点,易受反应液中pH的影响,进而影响了铁的配合效率[23]。从图2可以看出,香菇多糖铁(Ⅲ)配合物反应液最佳pH为8.0,与石德成[23]、马莹[24]等研究结果一致。
图2pH对铁结合率的影响Fig.2 Effect of pH on the rate of iron combination
2.2.3 时间对铁结合率的影响 从图3可以看出,配合反应时间在0.5~2.5h时,铁结合率不断增大,在1.0~2.5h时,铁结合率虽有增加,但其增长幅度较小。当配合反应时间为1.0、1.5、2.0h时其铁结合率分别为11.13%、11.16%、11.23%,在反应时间为2.5h时铁结合率达到最大值11.27%,当反应时间延长至3.0h时,其铁结合率小幅度降低,这可能由于当香菇多糖铁(Ⅲ)配合完全后继续水浴搅拌易使配合物发生解离反应,继而导致铁结合率降低。从图3中可知,香菇多糖铁(Ⅲ)配合物中铁结合率随着时间的延长先增高后降低。
图3 时间对铁结合率的影响Fig.3 Effect of time on the rate of iron combination
2.2.4 温度对铁结合率的影响 从图4可知,铁结合率在温度为40、50、60℃时随着温度的升高而增大,温度为60℃时铁结合率最大为11.4%,反应液温度由60℃升高到90℃时铁结合率逐渐降低并趋于平缓。这可能是由于反应液温度过高时,溶液中的分子运动增强,离子振动剧烈,不利于多糖配体与聚合铁核间接触发生配合。从图4中可以看出,香菇多糖铁(Ⅲ)最佳配合温度为60℃。
图4 温度对铁结合率的影响Fig.4 Effect of temperature on the rate of iron combination
2.3 响应曲面法优化实验
2.3.1 回归模型的建立及数据分析 根据Box-Behnken Design(BBD)组合设计原理,选取香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH和温度3个因素作为自变量,铁结合率(R)为响应值,设计了17个实验点的响应面分析实验,实验结果见表2。
利用Design Expert V 8软件对表2中实验数据进行多元回归拟合,从表3中可以看出,数据分析后所建立的模型回归极显著(p<0.01),该方程的一次项A、B和交互项AB极显著(p<0.01),说明香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH是优化实验中对铁结合率影响最显著的因素。从表3中可知,方程的二次项A2、B2、C2表现也为极显著(p<0.01)。
通过对数据进行多元拟合分析获得响应值R对自变量的多项回归方程:R=-46.82+11.58A+0.89B+ 1.24C+1.46AB-6.49A2-0.14B2(方程中项系数极小时忽略此项)。该模型的相关系数R2=0.9896,调整R2=0.9762,说明该模型拟合程度较好,可用来分析和预测香菇多糖铁(Ⅲ)配合物合成工艺。
表2 Box-Behnken Design变量值及响应值Table.2 Values of variables and responses in Box-Behnken design
表3 多元方程方差分析表Table.3 ANOVA for the quadratic equation
2.3.2 响应曲面分析 图5~图7给出了香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH和温度3因素之一取零水平时其他2因素对于响应值R的影响。通过对响应曲面图5观察发现:香菇多糖与柠檬酸三钠质量比较低,pH较小时,铁结合率较低。随着香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH的增加铁结合率不断增大。香菇多糖与柠檬酸三钠质量比在一定范围内时,增大反应液中的pH将有助于提高铁结合率。从图6中可知,在pH6.0时,随着香菇多糖与柠檬酸三钠质量比的增加,铁结合率先增大后减小,这是由于随着时间不断增加使香菇多糖与铁(Ⅲ)逐渐络合从而增加了铁结合率,当多糖分子中铁结合位点与铁络合完全后随着时间的增加又发生了解离反应,导致铁结合率降低。图7表明,在香菇多糖与柠檬酸三钠质量比为1.5时,反应液的pH与温度对铁结合率的影响比较来看,pH对铁结合率较显著。可见,3种因素对铁结合率及响应值R影响均不是简单的线性关系,因素之间的交互作用也起到重要的作用。
图5 香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、pH及其交互作用对铁结合率的响应曲面图Fig.5 Response surface of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate,pH and their interaction on the rate of iron combination
图6 香菇多糖与柠檬酸三钠质量比、温度及其交互作用对铁结合率的响应曲面图Fig.6 Response surface of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate,temperature and their interaction on the rate of iron combination
图7 PH、温度及其交互作用对铁结合率的响应曲面图Fig.7 Response surface of pH,temperature and their interaction on the rate of iron combination
2.3.3 最佳配合实验及验证 通过对数据的处理分析,在香菇多糖与柠檬酸三钠质量比为1.8,pH为8.0,温度为68.7℃条件下,R的最大预测值为12.53%。在以上条件下做5次验证实验,铁结合率的平均值11.69%。预测值与实际值接近,说明该回归模型所优化出的配合工艺是合适有效的。因此,响应曲面法优化得到的香菇多糖铁(Ⅲ)配合物的合成工艺可以用来指导实际生产。
3 结论与讨论
实验通过响应曲面法优化出香菇多糖铁(Ⅲ)配合物合成工艺:香菇多糖与柠檬酸三钠质量比为1.8,pH为8.0,温度为68.7℃。实验中铁结合率预测值为12.53%,通过验证结果(11.69%)表明,优化出的配比工艺条件合理、有效,具有可行性。
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Optimization of synthesis of lentinan-Iron(Ⅲ)complex by response surface methodology
REN Guang-ming1,2,GUO Xing1,CHEN Zhi-xin1
(1.College of Forestryource and Science,Yichun 153000,China;2.College of Resource and Environmental science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
Based on the single factor tests,the effects of mass ratio between lentinan and catalyst sodium citrate,pH reaction temperature on iron combination rate of lentinan-Fe(Ⅲ)were designed using Box-Behnken to assess the combination rate of iron(Ⅲ).A prediction model was established.The optimal synthesis conditions were mass ratio between lentinan and catalyst sodium citrate of 1.8,pH8.0,reaction temperature of 68.70℃,iron combination rate of lentinan-Fe(Ⅲ)was 11.69%.It was generally accepted that the response surface method was scientific and optimum for the synthesis of lentinan-Iron(Ⅲ)complex.
lentinan;lentinan-Iron(Ⅲ)complex;response surface methodology
TS201.1
B
1002-0306(2014)04-0251-05
2013-05-13
任广明(1984-),女,博士研究生,研究方面:微生物学。
黑龙江省森林工业总局项目(sgzjY2011020)。