葡萄糖氧化酶的固定化及其在快速检测中的应用研究现状

朱运平，刘文清，李秀婷，3，*，肖 林，王雅珍，伍少明，范园园

（1.北京工商大学食品学院，北京100048；2.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京市食品风味化学重点实验室，北京100048；4.山东龙力生物科技股份有限公司，山东禹城251200）

葡萄糖氧化酶的固定化及其在快速检测中的应用研究现状

朱运平1，2，刘文清1，李秀婷1，3，*，肖 林4，王雅珍1，伍少明1，范园园1

（1.北京工商大学食品学院，北京100048；2.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京市食品风味化学重点实验室，北京100048；4.山东龙力生物科技股份有限公司，山东禹城251200）

游离葡萄糖氧化酶在生产应用中易失活、储存稳定性差的缺点促进了人们对葡萄糖氧化酶固定化的方法及固定化载体的研究。固定化葡萄糖氧化酶在稳定性、重复使用率等方面具有显著的优势，在食品、医药、药物残留检测等领域发挥着重要作用，使得葡萄糖氧化酶的固定化技术成为人们热衷的前沿生物技术之一。本文主要综述了葡萄糖氧化酶的固定化方法与固定化载体，并对固定化葡萄糖氧化酶在快速检测中的应用进行了阐述。

葡萄糖氧化酶，固定化，方法，快速检测

葡萄糖氧化酶（GOD，E.C.l.l.3.4）能够催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，因其具有高效、专一、反应条件温和等特点在食品、医药、发酵等领域中广泛应用。游离的葡萄糖氧化酶在应用中存在稳定性差、易失活、酶与底物难以分离，不利于产物的回收与连续生产等缺点[1-2]，因此，近年来人们致力于研究将游离葡萄糖氧化酶进行固定化，以弥补游离葡萄糖氧化酶在应用中的不足。酶固定化技术就是将酶束缚在某种载体中，保持酶活力，使固定化的酶能够进行催化反应，并且可以重复使用[3]。传统的葡萄糖氧化酶固定方法及载体存在一定缺陷，如酶易泄露，酶活损失较高，因此，目前国内外学者不断改进和发展新的固定化方法及固定化载体以解决目前葡萄糖氧化酶固定化过程中存在的问题，并不断开拓固定化葡萄糖氧化酶的应用领域。如用具有导电性的金纳米粒子固定葡萄糖氧化酶制备生物传感器应用于快速检测[4-6]。

葡萄糖氧化酶固定化的关键在于选用合适的固定化方法及固定化载体。本文对葡萄糖氧化酶的固定化方法、固定载体，及其相应固定化酶在食品快速检测方面的应用现状进行了综述，旨在为固定化葡萄糖氧化酶的深入研究与应用拓展提供理论依据。

1 葡萄糖氧化酶固定化技术的研究现状

1.1 葡萄糖氧化酶的固定化方法

关于葡萄糖氧化酶的固定化方法已有大量的文献报道，不同的固定化方法对葡萄糖氧化酶的酶活性、稳定性、重复使用率均有不同影响。目前葡萄糖氧化酶的固定化方法主要有四种：吸附法，包埋法，交联法，共价结合法。其中吸附法和包埋法属于物理法，交联法和共价结合法属于化学法[7-8]。

通过传统固定化方法对葡萄糖氧化酶的固定，使得固定化酶不仅最适反应温度得到了上升，酶的温度稳定性也相应提高；固定化对酶反应最适pH也有影响，一般使酶pH稳定性提高；同时固定化酶表现出了良好的储存稳定性。张岳勋等[10]通过用羟基磷灰石为载体以吸附法固定葡萄糖氧化酶，使酶最适温度提高了4℃，最适pH由原游离酶5.6上升到6.5，回收率提高了35.1%。肖志方等[11]以海藻酸钙凝胶颗粒为载体采用包埋法将葡萄糖氧化酶固定，与游离酶相比最适温度及pH分别提高了7℃、0.6，固定化葡萄糖氧化酶平均酶回收率为61.69%，重复使用率及储存稳定性也均有提高。Rauf及周涛等[12-13]分别采用交联法与共价结合法对葡萄糖氧化酶固定化进行了研究，结果表明，固定化酶在pH稳定性及储存稳定性方面均有明显提高。

1.2 葡萄糖氧化酶的固定化载体

葡萄糖氧化酶的固定化按载体不同可分为：传统载体材料固定及新型载体材料固定。传统载体材料主要包括无机载体，有机高分子载体；新型载体材料分为磁性载体，导电载体等[14]。

1.2.1 传统载体材料在葡萄糖氧化酶固定化中的应用

1.2.1.1 无机载体在葡萄糖氧化酶固定化中的应用

无机载体不仅价格低廉，而且具有来源方便、无毒、机械性及稳定性好的特点。但无机载体结构不易改变，影响了载体与酶之间的键合能力，而且在固定过程中会产生传质阻力，均不利于酶与固定载体的结合。通过对无机载体分子进行适当的修饰可以改善此类载体对葡萄糖氧化酶的固定化效果。如美国、德国多家研究机构通过对氧化铝或二氧化硅无机载体进行修饰，显著改善了酶与固定载体的结合效果[15]。

1.2.1.2 有机高分子载体在葡萄糖氧化酶固定化中的应用 有机高分子载体材料分为两种：天然高分子凝胶载体与合成高分子有机材料载体。

a.天然高分子凝胶载体：天然高分子凝胶载体无毒、传质性好，但是强度低、易被微生物分解、使用寿命短。天然高分子载体在酶的固定化过程中能够提高酶的亲和力与生物相容性，有利于酶的固定化，改善酶促反应的微环境。琼脂、海藻酸钠等天然高分子载体材料已被广泛应用，壳聚糖、甲壳素及其衍生物和丝素膜等则是新发展起来的天然高分子载体。

采用戊二醛，壳聚糖等天然高分子作为葡萄糖氧化酶固定载体，固定化酶不仅在操作稳定性、温度稳定性、pH稳定性与底物亲和力方面较游离酶显著增强；利用交联法将壳聚糖作为葡萄糖氧化酶的固定载体，制备生物传感器能明显增加膜的传导性，这为固定化葡萄糖氧化酶在生物传感器方面的应用提供了科学依据[16-17]。此外，有研究表明用赖氨酸修饰后的壳聚糖微球载体及以戊二醛作为交联剂的壳聚糖微球应用于葡萄糖氧化酶的固定化中，不仅操作简单，而且固定化的葡萄糖氧化酶具有很好的热稳定性、贮存稳定性、重复使用稳定性，底物亲和力也有所提高[18-20]。可见将天然高分子载体用于固定葡萄糖氧化酶具有显著优势。

b.合成高分子有机材料载体：常见的合成高分子有机材料主要有聚丙烯酰胺，聚乙烯醇等。合成高分子有机材料强度大，但是传质差，近些年来人们开发出来了一些新型优良载体，如聚乙烯醇氧化物、聚乙烯醇冷冻胶、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯/聚苯乙烯磺酸钠PF凝胶载体（对苯二酚和甲醛聚合物）、多孔醋酸纤维素球形载体等。Rauf等[12]用醋酸纤维素有机玻璃固定葡萄糖氧化酶，不仅使酶的最适温度提高，而且使酶呈现了良好的操作稳定性和储存稳定性。

1.2.2 新型载体材料在葡萄糖氧化酶固定化中应用

1.2.2.1 磁性载体在葡萄糖氧化酶固定化中的应用

磁性载体就是在具有磁性微粒的表面修饰功能性基团，使其与目标分子、细胞或胶体颗粒产生亲和性，从而利用磁性颗粒制备出来的合适的载体[21]。磁性载体固定葡萄糖氧化酶主要是利用其磁效应，使固定化酶在反应体系中能够被外磁场富集、分离和回收，方便了对酶反应进程的控制，同时也提高了酶的使用效率[13]。如带有磁性的纳米颗粒（NPs）合成Co-B/SiO2/NH2NPs用于固定葡萄糖氧化酶，在生物燃料细胞和生物传感器上应用，具有高灵敏度与稳定性[22]。

表1 固定葡萄糖氧化酶方法及其优缺点Table.1 The merits of different methods on immobilization of glucose oxidase

很多学者在磁性载体的利用上多会选择铁氧化物，如姜德生等[20]将壳聚糖与Fe3O4纳米粒子制成复合微粒，再与戊二醛交联后使复合微球硬化，使得固定化的酶易于从混合体系中分离。另外，程娟[23]利用CuTAPP-Fe3SO4纳米复合粒子固定葡萄糖氧化酶并且构建了灵敏度高，稳定性好的光纤葡萄糖生物传感器。磁性载体方便分离回收的优点使得人们越来越亲睐用磁性载体固定葡萄糖氧化酶。

1.2.2.2 导电载体在葡萄糖氧化酶固定化中的应用导电载体分为两类，一类是导电高聚物载体，一类是导电复合物载体。

导电高聚物主要是含共轭结构和带电的聚合物，包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩等。Talay等[24]用聚吡咯和聚氨酯复合材料对葡萄糖氧化酶进行了固定化，并且制备成了生物传感器，固定化酶在100bar、30℃时酶活力和比活达到最高，分别为0.040U/cm2和4.9U/mg，并且储存21d酶活性仍保留80%。

导电复合体是通过对一些特殊物质复合形成导电复合体。吴国权等[25]用纳米碳管和纳米金导电复合体对葡萄糖氧化酶固定化，并且制成了传感器用于血糖浓度的测量，该生物传感器不仅灵敏度高、稳定性强、重复性好，而且成本低，操作简单快速，能定量检测血糖浓度。采用导电复合体固定化葡萄糖氧化酶制备生物传感器在集成化设计与实现多通道多参数同步检测方面具有推动作用。而且导电载体因其具有导电性在葡萄糖氧化酶固定化中的应用也多见于生物传感器的开发。

2 固定化葡萄糖氧化酶在快速检测中的应用

由于葡萄糖氧化酶在啤酒氧化，果汁澄清及面粉品质改良等方面具有显著改善产品品质的效果[26-27]，固定化葡萄糖氧化酶在此类食品加工领域中也有广泛应用。而固定化葡萄糖氧化酶另一个重要的应用领域是快速检测行业，国内外学者对固定化葡萄糖氧化酶在快速检测的领域也有多项研究。本部分主要针对固定化葡萄糖氧化酶在食品，医药等领域的快速检测行业应用现状进行综述。

2.1 固定化葡萄糖氧化酶在葡萄糖含量检测中的应用

随着固定化酶技术的不断发展，生物传感器应运而生，科学工作者将固定后的葡萄糖氧化酶制成生物传感器应用在食品、医学等领域。生物传感器在食品方面主要用于食品中葡萄糖含量的控制与分析检测，如在酿酒过程中对葡萄糖浓度进行连续检测，更好地控制发酵过程；葡萄糖可被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与辣根过氧化物酶发生颜色反应，其反应产物在530nm下的吸收峰度值会随葡萄糖浓度的增加而增加，利用这一原理可以测定葡萄糖含量[28-30]，因此，在医学上，该种生物传感器多用于糖尿病人血糖含量的检测。固定化葡萄糖氧化酶检测葡萄糖含量具有反应时间短、保存期较长、灵敏度高、反应快捷等优点[31]。

2.2 固定化葡萄糖氧化酶在葡萄糖酸制备中的应用

葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖生产葡萄糖酸和过氧化氢。工业上将葡萄糖氧化酶固定化后生产葡萄糖酸可以提高葡萄糖氧化酶的使用率，节约生产成本[32]。

2.3 固定化葡萄糖氧化酶在蛋白纯化中的应用

在蛋白生产工业中，固定化葡萄糖氧化酶主要用于蛋白的纯化，通过消除蛋白中的葡萄糖，提高蛋白纯度。Sisak等[33]通过实验用戊二醛做交联剂固定葡萄糖氧化酶来消除蛋白中的葡萄糖，从而使蛋白质量显著提高。

2.4 固定化葡萄糖氧化酶在药物残留检测中的应用

在药物残留检测中，固定化葡萄糖氧化酶作为偶联剂的免疫传感器可用于磺胺类药物的检测。葡萄糖氧化酶偶联SMD后形成葡萄糖-SMD，利用抗原与抗体结合产生电信号，通过氧化峰电流的增值来测定SMD含量[34]。在制成的葡萄糖氧化酶-克伦特罗免疫传感器中，可对克伦特罗（瘦肉精）进行快速检测，灵敏度高、重现性好、检测限低[35]。

3 展望

固定化葡萄糖氧化酶的诸多优点，使得科研工作者们持之以恒地对固定化技术进行改善，虽然目前固定化葡萄糖氧化酶仍有缺点，但我们相信随着固定化氧化酶研究的不断深入，葡萄糖氧化酶的固定化技术会更加成熟，固定化葡萄糖氧化酶的应用会更加广泛。

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Immobilization of glucose oxidase and its application in rapid detection

ZHU Yun-ping1，2，LIU Wen-qing1，LI Xiu-ting1，3，*，XIAO Lin4，WANG Ya-zhen1，WU Shao-ming1
（1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing 100048，China；4.Shandong Longlive Bio-technology Public Limited Company，Yucheng 251022，China）

Drawbacks of free glucose oxidase in application of production encourage people to study on the immobilization of glucose oxidase.The well stability，high reproducibility and other virtues of immobilized glucose oxidase have a significant advantage.Meanwhile，the immobilized enzyme plays an important role in food，medicine，residue detection of drugs.All of these make glucose oxidase enzyme immobilization technology be one of the most important frontier areas of biological technology.This article mainly summarized these various methods and fixed carriers of the immobilization of glucose oxidase，and the application of immobilized glucose oxidase in rapid detection were also stated.

glucose oxidase；immobilization；method；rapid detection

TS201.1

A

1002-0306（2014）04-0337-04

2013－05－23 *通讯联系人

朱运平（1980-），女，博士，副教授，研究方向：功能性食品。

国家自然科学基金项目（31101332）；北京市属高等学校人才强教计划资助项目（PHR 20110872）；国家高技术研究发展（863）计划项目（2012AA021502）；国家科技支撑计划项目（2011BAD24B01）。