广西甜茶生理活性成分及其提取纯化研究进展

葛益银，张 涛，张凌云，王忠华，*

（1.浙江万里学院生物技术研究所，浙江宁波315100；2.华南农业大学园艺学院，广东广州510642）

广西甜茶生理活性成分及其提取纯化研究进展

葛益银1，2，张 涛1，张凌云2，王忠华1，*

（1.浙江万里学院生物技术研究所，浙江宁波315100；2.华南农业大学园艺学院，广东广州510642）

广西甜茶，为悬钩子属，具有较高的食用与药用价值，如降血糖、血脂、血压、促进新陈代谢、调节人体免疫功能等功效。广西甜茶含有甜茶苷、多酚、氨基酸、黄酮类化合物等多种生理活性成分，目前人们采用各种方法提取与纯化这些功能性成分，并取得较大进展。本文对广西甜茶的生理活性成分、药理作用、分离纯化工艺及其开发与应用研究作了较详尽的综述，为广西甜茶的进一步研究和开发提供依据。

广西甜茶，生理活性成分，分离纯化

广西甜茶（Rubus suavissimus S.Lee），又名甜叶悬钩子，是二十世纪八十年代初调查发现的蔷薇科悬钩子属一新种，为广西特有的无毒、低热能、高甜度和具有保健功能的野生珍稀甜味植物[1-2]。其为多年生带刺落叶灌木，茎直立或倾斜，常被白粉，幼苗时紫红色，上端皮刺较密，成长后变绿色，上半部无皮刺或稀具皮刺，先端常弯垂，髓心大；枝条稀疏，圆柱状，稍软，亦常弯垂，绿色，被白粉，疏生皮刺，上端多平滑，二年生枝条具短枝数条至十余条不等。单叶互生，掌状深裂，裂片披针形或椭圆形，中央裂片较长，先端渐尖呈尾状，边缘具重锯齿；花单生，白色；聚合果卵球形，幼时灰青色，熟时橙红色，味甜可食[3]。悬钩子在我国分布较广，长江、珠江流域都可见到；在朝鲜、日本等国也有分布。但有甜味的主要分布在我国广东、广西及湖南、江西等省区[4]。

自1981年广西甜茶被命名以来，国内外的研究人员对其进行了广泛的研究，包括野生种质资源评价、良种选育、化学成分、医学、毒理学等方面。本文就广西甜茶的生理活性成分、功能特性与分离纯化工艺及其产品开发与应用研究状况进行了较全面的综述，为广西甜茶的进一步开发利用提供新的思路与技术支撑。

1 广西甜茶的生理活性成分

据测定，甜茶干茶中含碳水化合物60%左右；蛋白质及氨基酸1.8%～12.6%，且含有八种人体必须氨基酸；鲜叶维生素含量为64.01～114.86mg/100g，主要是类胡萝卜素、维生素C、维生素E、叶酸、尼克酸、维生素A、维生素B12等；刚长定型绿色叶片含量最高，幼嫩芽叶次之，老黄叶最低。甜茶干茶总灰分在4.86%～5.2%之间，主要矿物质为钾、钠、钙、铁、镁、铝、锰等元素以及磷酸盐、碳酸盐、氯化物等无机盐[5]。广西甜茶富含各种矿物质含量，其中甜茶叶的Ca、K、Na、Mg和Mn含量明显大于根和茎[6]。

此外，许多学者对甜茶叶中的化学成分进行了定性研究，他们利用亲脂性原理，发现提取物中含有皂甙、甾体及萜类、有机酸、香豆素与萜类内酯化合物等[7-8]。他们还利用RP-HPLC法，采用保留时间定性，证实了甜茶叶中含有甜茶素、多酚、氨基酸、黄酮类化合物等；其水提物的水解产物中含有槲皮素与山奈酚[7-8]。

2 广西甜茶的药理作用

广西甜茶，民间称为“神茶”，常饮有滋肝补肾、清热解毒、生津润肺、止咳化痰和利咽的功效，广泛用于医药、饮料和食品中。对于广西甜茶的具体药理作用，以及生理活性成分的功效，国内外学者开展了卓有成效的研究，取得较大进展。主要包括以下几点。

2.1 抗过敏、抗炎的作用

过敏反应是指一部分人对花粉、化学物质、动物皮毛甚至某些食物等有特殊的感受性，是一种异常的免疫反应。国内外的研究普遍认为甜茶多酚是抗过敏活性的主要成分[9-10]，韦保耀等[11]采用Morgan-Elson法追踪测定广西甜茶抗过敏活性成分，经过薄板层析、紫外光谱、红外光谱定性及高效液相色谱检测，发现广西甜茶中抗过敏有效成分为C6-C3-C6水解型鞣花鞣质。滕建文等[12]采用小鼠被动皮肤过敏实验、小鼠耳廓肿胀实验、大鼠皮肤毛细血管通透性实验和二硝基氯苯致迟发型皮肤过敏实验对甜茶提取物进行抗过敏性评价，结果表明甜茶的抗过敏活性物质属于水解多酚类，而且其作用与纯度有关。方耀高等[13]则进行2，4-二硝基氟苯（DNFB）及绵羊红细胞（SRBC）诱发的小鼠迟发型过敏反应和小鼠异种被动皮肤过敏反应（PCA），观察给予连续口服广西甜茶提取物的抗过敏作用。结果发现与模型组相比，连续口服广西甜茶提取物125、250、500mg/kg均能显著抑制由DNFB诱发小鼠耳肿胀及血管通透性的增高。高山等[14]采用大鼠被动皮肤过敏等类似的方法，观察甜茶提取物的抗过敏作用。结果表明甜茶提取物能明显抑制大鼠被动皮肤过敏和小鼠耳异种被动皮肤过敏引起的炎症渗出：延长豚鼠支气管痉挛引起哮喘发作的潜伏期；减少二硝基氯苯所致迟发型皮肤过敏小鼠耳片重量，并对组织胺诱发豚鼠足跖肿胀有一定的对抗作用。

2.2 抗氧化、清除体内自由基的功效

谭冬明[8]利用分光光度法进行了甜茶各成分清除自由基实验和测定总抗氧化能力，并与人工合成的抗氧化剂BHT比较。结果表明，甜茶抗氧化能力有效成分为甜茶黄酮，在同浓度下清除自由基能力：甜茶黄酮提取物＞BHT＞粗品，甜茶素没有清除自由基能力；同浓度下（0.5mg/mL）总抗氧化能力：甜茶黄酮提取物＞BHT＞粗品。曹培培等[15-16]则是采用·OH化学发光体系，加入不同浓度甜茶醇提物后测定发光强度来检测其自由基清除能力。结果表明，甜茶提取物在5～10mg/mL浓度范围内具有较强的自由基清除能力和抑制不同氧化剂激发的脂质过氧化作用。

2.3 对变形链球菌的抑制作用

李莉[17]采用比色法观察不同浓度的甜茶提取物-甜茶皂苷对变形链球菌的生长、玻棒黏附的影响，结果表明甜茶皂苷在浓度高于0.625g/100mL时对变形链球菌的黏附有抑制性，黏附力随甜茶皂苷浓度升高而降低。黄丽微[18]通过体外研究发现，在试管稀释法实验中，甜茶甙浓度在20g/100mL以上的培养基内无变链菌生长，浓度在10g/100mL以下的培养基内均有变链菌生长，且随着甜茶甙浓度的降低，溶液中变链菌的浓度增加。甜茶甙可抑制变链菌产酸，并显著抑制变链菌在表面的粘附作用，其抑制作用明显高于同浓度的木糖醇。甜茶甙对变链菌菌液中葡萄基转移酶的酶活性也具有一定抑制作用，降低了变链菌水不溶性胞外多糖的合成，较同浓度的木糖醇有更明显的抑制作用[18]。

2.4 具止咳祛痰、抗炎、止痛和镇静作用

民间早有使用甜茶代茶饮用的习惯，用于治疗咽炎。目前有研究报道甜茶提取物有抗过敏和舒张支气管作用[19-20]。钟正贤等[21]采用动物实验，结果发现广西甜茶提取物对小鼠浓氨水实验性咳嗽有止咳作用；能明显增加小鼠呼吸道酚红排出量；抑制小鼠二甲苯所致耳肿；可减少醋酸所致扭体次数和抑制自发活动；广西甜茶提取物的急性毒性实验表明，其最大耐受量为199.8g/kg。

2.5 抑制动物小肠收缩运动作用

黄彦峰等[22]采用离体肠段实验法和小肠推进运动实验法，观察不同浓度甜茶提取液对家兔离体小肠收缩活动及小鼠在体小肠推进运动的效应。结果发现对家兔不同部位离体小肠平滑肌的收缩运动均有抑制作用，使其张力降低，收缩幅度变小，而高剂量组对收缩频率有减少作用；对小鼠小肠运动有明显的抑制作用。同样，赵丽平等[23]采用常规离体灌注小肠平滑肌标本活动的实验方法，针对不同剂量的甜茶提取液，观察用药前后的平滑肌收缩幅度和收缩频率的变化。结果发现在收缩幅度方面，低、中、高剂量组均有高度显著性差异；在收缩频率方面，低剂量组无变化，中、高剂量组有显著性差异。滴加乙酰胆碱后，被抑制收缩的离体小肠的收缩力显著上升，表明两者有一定的拮抗作用。

2.6 抗肿瘤作用

吴燕春等[24]研究发现，广西甜茶总黄酮在体外可抑制S180、H22和L1210肿瘤株的增殖，其中对H22抑制作用最强（IC5046.31μg/mL）；对S180抑制作用次之（IC5071.48μg/mL）；对L1210抑制作用最弱（IC50163.59μg/mL）。黄荣岗等[25]则是对广西甜茶提取物体内抗肿瘤实验进行研究，分别考察提取物对小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌H22移植瘤的作用，结果表明低、中、高剂量组甜茶提取物均对小鼠肉瘤S180或肝癌H22移植瘤有不同程度的抑制作用，其中高剂量组对两种瘤体的抑制作用均达到显著水平。

3 广西甜茶生理活性成分的提取与纯化技术研究

纵观广西甜茶的生理活性功能，起主要作用的是甜茶多酚、黄酮类物质以及甜茶苷三类物质。因此人们采用各种方法对广西甜茶上述三类生理活性成分开展了分离纯化技术的比较与工艺优化研究，取得可喜进展。

3.1 甜茶多酚的提取与纯化

据研究表明，广西甜茶中含有超过10%的甜茶茶多酚[4]，在甜茶素浸提过程中绝大部分甜茶茶多酚也被提取出来，这些甜茶茶多酚是甜茶粗提物苦涩味的主要来源。高程海等[26]通过对水抽提、醇抽提、水提碱转法三种甜茶多酚抽提工艺进行对比，得出水提碱转法为较好的一种抽提方法。通过正交实验得出，影响甜茶多酚提取效率的主要因素为抽提时间，其次为pH，受提取温度和料液比的影响较小；最佳提取工艺为提取温度85℃，时间30min，pH8.5，料液比1∶10，在此条件下的甜茶多酚得率为3.91%。程雅芳等[27]利用响应面分析法对复合酶辅助提取甜茶多酚的工艺进行了优化，优选出最佳提取条件为纤维素酶和果胶酶以3∶4的比例混合而成的复合酶；在45℃的水浴条件下，加酶量为0.6%（m/m）、pH4.95、酶解时间47.76min、料液比1∶23.58（g/mL），酶解后的原料用体积分数40%的乙醇溶液、料液比1∶28（g/mL）、温度70℃回流提取70min，甜茶茶多酚得率为13.32%。

甜茶素粗提物废渣中含有丰富的甜茶茶多酚，具有较高的开发利用价值。林继元等[28]通过静态吸附实验，选出DM-301大孔吸附树脂对甜茶茶多酚有较高的吸附量和很高的解析率，是分离纯化甜茶茶多酚的良好吸附剂。通过动态吸附实验得知，提取液适合的上柱浓度为2mg/mL，上柱液的pH为5.5，流速为1.2BV/h。通过对比实验，选饱和柱的最佳洗脱剂为70%的乙醇溶液；洗脱品中甜茶茶多酚纯度达72.12%。水解型鞣花鞣质为广西甜茶中主要的一类活性物质，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。高程海等[29]研究了8种大孔吸附树脂及聚酰胺对水解鞣质的吸附与解析性能，从中选出LSA-21树脂具有较大吸附量和解吸率。薛茗月等[30]进一步通过动态吸附实验得知当上柱浓度为3mg/mL、pH为4.8、流速为1.2BV/h，用60%乙醇洗脱可得相对较高纯度的水解鞣质（71.03%）。最近有学者以甜茶根为原料，经提取、有机溶剂萃取、重结晶等，得到了鞣花酸晶体。

3.2 黄酮类物质的提取与纯化

黄酮类化合物是植物次生代谢产物之一，广泛存在自然界的某些植物和浆果中，其功效是多方面的，可有效清除体内的氧自由基、改善血液循环、降低胆固醇等。研究表明，甜茶各部位总黄酮含量依次为嫩叶、中茎皮、老茎皮、果实、嫩茎皮、老叶、中茎、老茎[31]。林继元等[32]通过正交实验得出最佳提取条件为乙醇浓度30%，料液比1∶30，提取温度50℃，提取时间40min。在该条件下总黄酮的提取得率为3.85%[33]。其中影响广西甜茶叶总黄酮提取效果的主次因素为：乙醇浓度＞溶剂用量＞提取次数＞提取时间。程雅芳等[34]则是采用乙醇回流提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和复合酶辅助提取法分别对广西甜茶中总黄酮的提取工艺进行了研究。实验结果表明，超声波辅助提取的方法提取率最高，其最佳提取工艺条件为乙醇浓度为50%（v/v），料液比为1∶40，超声波功率和提取时间分别为52W、30min，提取温度为40℃，其提取得率可达12.69%。至于如何富集纯化广西甜茶中的黄酮类物质，有学者利用聚酰胺对广西甜茶提取物进行分离层析，并采用紫外分光光度法，以根皮苷含量为指标，从而筛选出的最优工艺参数，即将样液浓度控制在3.39～5.24mg/mL范围内，上样液体积控制在4BV以内，室温下以流速2BV/h吸附饱和；解吸时先用4BV水洗，再用6BV的95%乙醇解吸，流速2BV/h，收集洗脱液。结果95%乙醇洗脱液总固物中总黄酮纯度可达71.55%，精制度高达591.94%[35]。天然黄酮类化合物种类众多，而以广西甜茶叶为原料提取黄酮，经水解、有机溶剂萃取、柱层析等，得到高纯度甙元；经熔点、TLC、液相色谱、红外光谱、核磁共振法等进行结构表征分析，证实甜茶含有黄酮甙，其甙元为槲皮素和山奈酚[36]。

3.3 甜茶苷的提取与纯化

广西甜茶的主要甜味成分是甜茶苷（Rubusoside），又称甜茶素、甜叶悬钩子苷，为斯替维醇（Steviol）和葡萄糖结合而成的四环二萜甙，在化学结构上与甜叶菊苷（Stevioside，斯替维甙）相似[37]。其甜味的纯正程度接近蔗糖，相对甜度是2%蔗糖溶液的150倍[38]。甜茶苷作为一种高甜度、低热量、口味纯正的非蔗糖天然甜味剂，日益受到重视，是广西甜茶中有效活性成分提取纯化研究最多的，也取得较大进展。如卢昕等[39]采用反相高效液相色谱法（反相C18柱；甲醇-水体积比为85∶15）溶液为流动相，流速1.0mL/min；紫外检测（波长210nm；柱温20℃；外标法定量）测定了广西甜茶中的甜茶素，结果表明甜茶素的质量浓度为20～1200mg/L时，其峰面积与质量浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.998。最近樊兰兰等[40]采用RSLC-DAD技术（色谱柱为Dionex RSLC120 C18柱（50mm×2.1mm，2.2μm），流动相为乙腈-水（36∶64），检测波长205nm，柱温40℃，流速0.3mL/min，进样量2μL）测定了广西甜茶制剂中的甜茶素含量，结果发现甜茶素的线性范围为0.03～0.6μg；样回收率为99.1%，RSD为0.97%（n=9）。林继元等[41]运用超声波辅助提取技术从广西甜茶中提取甜茶素可显著降低浸提温度，缩短浸提时间，提高浸提效率。以乙醇水溶液为浸提溶剂，在40kHz超声波条件下，广西甜茶甜茶素的最佳提取工艺条件为乙醇水溶液的浓度为30%，溶剂用量为30BV，浸提时间20min，浸提2次，浸提温度为40℃，甜茶素的提取率可达5.6%。周如金等[42]的研究结果表明AB-8树脂是理想的甜茶苷吸附剂，适宜纯化条件为：原料液质量浓度为7.7mg/L、pH约为8、流速为3BV/h、室温下以70%乙醇溶液为洗脱剂、用量为5BV或40℃下以60%乙醇溶液为洗脱剂。陈全斌等[43]以甜茶叶为原料，加水煮沸（3次）、过滤合并滤液、柱吸附、水洗至无色、75%乙醇洗脱、将洗脱液干燥得粗提、用无水乙醇溶解、过滤、旋干、精制产品。取精制品柱层析、重结晶等，制备出单体，经红外光谱、核磁共振结构表征分析，表明该化合物为甜茶苷。

4 广西甜茶的产品开发与展望

甜茶在广西民间一直作为茶饮用，在国内甜茶除了制作成品干茶外，也可制成袋泡茶或加工成茶饮料。在日本，甜茶被开发成多种饮料、糖果和药粒等。近年来，随着肥胖症、糖尿病及心血管病患者人数日益增多，人们越来越希望食品中所使用的蔗糖被无热值或低热值的甜味剂所替代，因而甜茶甙有望成为新的甜味剂，并作为一种新型的非致龋性糖代用品。在前人研究的基础上，陈小芳[44]按照保健食品的配方原则与健齿护齿的保健目标，通过正交实验，确定甜茶护齿含片的最优处方为甜茶甙5.5g，微晶纤维素20g，糊精74.5g，薄荷脑1g，再采用传统湿法制粒法，以片剂的生产方法制备。

综上所述，广西甜茶内含物质丰富，具有“茶、糖、药”3种功效，其发展前景非常广阔。从目前的研究技术与水平，结合广西甜茶自身的特点，未来的研究方向可从以下几个方面进行。第一是广泛收集野生甜茶种质资源的基础上进行广西甜茶选种与育种工作，同时开展相对应的绿色高效栽培技术研究，从而保证广西甜茶原料的品质与产量；第二是将传统茶类的加工方式融入广西甜茶的加工工艺中，制成各类茶饮料，拓宽广西甜茶的市场需求与销售渠道，更好地满足不同消费者的需求；第三是继续加强广西甜茶中各类生理活性成分分析与检测，并根据其特性分别开展最适提取纯化方法与工艺研究，同时开展广西甜茶各类生理成分的毒理学实验，为广西甜茶的进一步开发与利用提供科学依据。

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Research progress in physiologically active compounds，products isolation and purification of Rubus suavissimus S.Lee

GE Yi-yin1，2，ZHANG Tao1，ZHANG Ling-yun2，WANG Zhong-hua1，*
（1.Institute of Biotechnology，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；2.College of Horticulture，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China）

Guangxi sweet tea，Rubus suavissimus S.Lee was a kind of raspberry.It had high edible and medicinal value，such as reducing of blood sugar，blood fat，blood pressure，promoting metabolism，regulating the body’s immune function and so on.Rubus suavissimus S.Lee which was rich in nutritional components，containing several physiologically-active compounds like rubusoside，polyphenols，flavonoids，amino acids，etc. So far，many methods are used to extract and purify above functional ingredients and the advances have been gained.The biologically active components，pharmacological effects，separation and purification process development and application of Rubus suavissimus S.Lee were in detail reviewed in this paper，which would provide the basis for the further research and development of Guangxi sweet tea.

Rubus suavissimus S.Lee；physiologically-active compounds；isolation and purification

S571.1

A

1002-0306（2014）04-0388-05

2013－01－08 *通讯联系人

葛益银（1987-），女，硕士研究生，主要从事园艺植物资源利用方面的研究。