利用TLC和HPLC结合的方法定性检测尿液中的雌马酚

王安易，程永强，欧小群，刘肖南，李 婷，周 韵

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

利用TLC和HPLC结合的方法定性检测尿液中的雌马酚

王安易，程永强*，欧小群，刘肖南，李 婷，周 韵

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

雌马酚是人体肠道细菌分解大豆苷和大豆苷元的最终代谢产物之一，采用薄层色谱法（TLC）分离纯化尿液样品中的雌马酚后再进行高效液相色谱法（HPLC）定性检测，可有效减少染料木苷元的干扰，解决了仅依靠HPLC无法实现雌马酚有效分离的问题。以氯仿-甲醇（24∶1，v/v）作为TLC展开剂，染料木苷元的Rf值为0.29，雌马酚的Rf值为0.40。本方法具有准确度高，干扰度低等优点，为定性检测尿液中雌马酚提供了新的方法。

薄层色谱法，高效液相色谱法，雌马酚，大豆苷元

大豆异黄酮（soy isoflavones）的代谢产物之一——雌马酚（equol）与其前体物质大豆苷元（daidzein）相比具有更高的生物活性[1-6]。雌马酚的生物活性主要为抗氧化和雌激素样活性，还具有降低心血管疾病发病风险、抗肿瘤、缓解更年期症状等功能[7]。因此建立有效的雌马酚检测方法，对人群雌马酚生产者的鉴定，跟踪、了解人群饮食与疾病关系以及从雌马酚有效生产者体内分离筛选雌马酚肠道生产菌等均具有重要意义。目前应用最为普遍最为广泛的检测方法是高效液相色谱法（HPLC）。李岩等[8]建立了检测人体尿样中雌马酚的HPLC检测方法，王静等[9]建立了同时检测人尿中4种异黄酮组分的HPLC检测方法，王路等[10]建立了同时检测人尿中6种异黄酮组分的HPLC检测方法，通过不断探索和优化HPLC检测条件，人尿中可有效检测出的异黄酮种类增多，但是这些检测方法在应用于雌马酚检测时几乎都存在响应值低，受染料木苷元（genistein）干扰等问题，这给定性检测雌马酚以鉴定雌马酚有效生产者带来难度。人尿成分复杂，雌马酚含量较低，易受其他杂质干扰，所以探索浓缩纯化尿液中的雌马酚，消除染料木苷元干扰对雌马酚的准确定性检测具有重要意义。

目前用于分离纯化异黄酮的方法主要有柱层析法、固相萃取法、薄层色谱法等[11]。潘廖明[12]采用聚酰胺柱层析时，用不同浓度甲醇洗脱，可得到含量分别为90.30%大豆苷和92.0%染料木苷；Mauricio等[13]利用固相萃取法，并使用Strata X填料时，大豆异黄酮中各组分回收率最高，平均回收率为99.37%，可用于大豆异黄酮分离纯化；权静[14]利用薄层色谱法，用氯仿-甲醇-乙酸（93∶7∶0.5，v/v）作为展开剂成功分离了豆粕中的大豆苷元和染料木苷元，但是将这些方法应用于分离纯化尿样中雌马酚的相关报道较少。本文探索性地进行了HPLC检测条件优化，在效果不显著的情况尝试使用薄层色谱法（TLC）先对尿液样品中的雌马酚进行预分离，再进行HPLC定性检测。将雌马酚标准品与尿样同时进行TLC展开后比较Rf值，实验结果表明可以有效分离尿液中的雌马酚并排除染料木苷元的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

染料木苷元和雌马酚标准品 美国Sigma-AldrichCorporation；乙腈、甲醇 色谱纯，美国Dikma公司；乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、二氯甲烷、四氢呋喃、碘 分析纯，北京化学试剂厂；磷酸氢二钾 分析纯、乙酸 色谱纯，汕头市西陇化工股份有限公司；磷酸二氢钾 分析纯，广东光华股份有限公司；硅胶 青岛海洋化工厂分厂；GF254硅胶薄层板 德国Merck KGaA；纯净水 杭州娃哈哈集团；蒸馏水 实验室自制。

M-20A分析型液相色谱仪、SPD-M20A二极管阵列检测器 日本Shimadzu Corporation；反相C18色谱柱 日本Shiseido Corporation，4.6mm×50cm×5μm；GL-20G-Ⅱ离心机 上海安亭科学仪器厂；RE52-99旋蒸仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相检测条件优化

1.2.1.1 标准溶液配制 标准溶液配制参照文献[15]中的方法。染料木苷元储备液（1mg/mL）：染料木苷元固体标准储存瓶（1mg）中加入少量甲醇（色谱纯）将其完全溶解，全部转移至10mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。

染料木苷元标准液：取染料木苷元储备液1mL，用甲醇（色谱纯）定容于10mL容量瓶中，经0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性针头过滤器过滤后，即得染料木苷元标准液，于4℃冰箱中保存。

雌马酚储备液（1mg/mL）：向雌马酚固体标准储存瓶（10mg）中加入少量甲醇（色谱纯）将其完全溶解，全部转移至10mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。

雌马酚标准液：取雌马酚储备液1mL，用甲醇（色谱纯）定容于10mL容量瓶中，经0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性针头过滤器过滤后，即得雌马酚标准液，于4℃冰箱中保存。

混合标准液（genistein∶equol=20∶8，v/v）：取染料木苷元标准液80μL，雌马酚标准液200μL，经0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性针头过滤器过滤后，于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 对照组的HPLC检测条件 对照组采用刘肖南等[15]分析条件。色谱柱为Shiseido C18（4.6mm×50cm× 5μm）；采用二极管阵列检测器（PDA）；流动相包括水相和有机相，其中水相为0.1%（v/v）乙酸溶液，有机相为乙腈/甲醇（5/2，v/v）；其他检测参数为：柱温35℃，检测波长270nm，进样量20μ，流速0.8mL/min，灵敏度，0.020AUFs；采用梯度洗脱，详细洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序Table.1 HPLC elution program

1.2.1.3 改变有机相组成 在其他条件不变的情况下，分别向有机相中添加四氢呋喃（THF）和二氯甲烷（DCM）。有机相组成见表2。

表2 有机相组成Table.2 The composition of organic phase

1.2.2 利用薄层色谱法分离纯化尿液中雌马酚

1.2.2.1 尿样预处理方法 取10mL尿样置于50mL离心管中，加入pH=7.0的磷酸盐缓冲液[16]15mL，乙酸乙酯25mL，涡旋振荡器振荡20s，离心6000×g，5min后取上清液在65℃，0.04MPa，75r/min下旋蒸至溶剂全部蒸出。向蒸馏烧瓶加入1～2mL甲醇并涡旋振荡20s至蒸出物全部溶解后，经0.45μm有机滤膜过滤，于4℃冰箱中保存，保存时间不超过48h。

1.2.2.2 对照样品的配制 参照1.2.1.1中标准混合液配制。

1.2.2.3 雌马酚和染料木苷元薄层色谱定性和分离方法的建立 将GF254薄层板（10cm×10cm）在使用前于110℃活化30min。在距底边边缘1cm处用微型注射器点样，标准对照品和预处理好的样品点样量各为4μL。将GF254薄层板放入充满展开剂（见表3）蒸汽的层析缸内，预饱和20min后，上行展开8cm，取出薄层板，挥干后于充满碘蒸气的碘缸中显色。测定各斑点的Rf值并计算分离度R，确定最佳展开剂组成。

其中分离度R[17]的计算公式为：

用冷风吹去碘，收集色谱带，并用甲醇反复浸泡至被吸附的样品全部洗脱，将洗脱液氮吹至干，加入100μL甲醇，过0.45μm有机滤膜，于4℃冰箱中保存，以备HPLC检测。

表3 TLC展开剂的组成Table.3 The composition of developing solvent in TLC analysis

2 结果与分析

2.1 分离条件的选择

在液相色谱中，当固定相一定时，流动相的种类和配比能严重影响分离效果，并且反相高效液相中常使用THF和DCM调节流动相极性以获得更好的分离效果[18]。所以本文研究了改变流动相组成对雌马酚和染料木苷元分离效果的影响，结果见表4。当有机相组成为1%THF和5%THF时，虽然雌马酚和染料木苷元的保留时间和分离度都随着THF加入量的增加有所提高，分离度从0.88提高到1.41，但是与对照相比，分离度反而减小；继续增大THF的比例，分离效果并没有明显改善，而且基线显著向上漂移，所以THF并不能有效提高雌马酚和染料木苷元的分离度，去除染料木苷元的干扰。

当向原有机相中添加不同比例的DCM后，雌马酚和染料木苷元的保留时间均显著提前，但是分离度均低于对照组，并且染料木苷元出峰时间早于雌马酚。这可能是由于二氯甲烷的溶剂强度较乙腈、甲醇强，加入二氯甲烷，降低了整个流动相的极性，使染料木苷元和雌马酚的保留时间和洗脱顺序都发生了变化。

根据上述实验结果，加入THF或DCM后，雌马酚和染料木苷元分离效果均没有明显改善。因此，尝试通过改变流动相优化雌马酚的检测方法是比较困难的，所以探索其他实现雌马酚和染料木苷元有效分离的方法是极其必要的，经过研究，本文尝试使用TLC分离雌马酚并取得了理想的分离效果。

表4 流动相B组成对雌马酚和染料木苷元的保留时间和分离度的影响Table.4 Effect of mobile phase composition on the retention time and resolution of equol and genistein

2.2 薄层色谱法展开剂的确定

经过实验，展开剂比例和层析效果如表5和图1所示。

表5 不同展开剂的层析效果Table.5 Chromatographic separation of different developing solvents

当分离度＞1.5时相邻两斑点可达到基线分离[17]。所以只有当用展开剂Ⅲ时，展开后雌马酚和染料木苷元的分离度＞1.5，实现了基线分离，并且斑点显色效果好，说明将氯仿∶甲醇（24∶1，v/v）作为TLC展开剂最为理想（图1）。

图1 薄层板色谱图Fig.1 Thin-layer chromatogram of standards

2.3 雌马酚的分离纯化效果

尿液样品薄层色谱图如图2所示，从图2可以看出，虽然由于标准对照品与样品浓度相差较大而出现轻微的“边缘效应[17]”，但是根据薄层板右端标准对照品的Rf值，初步推断尿液样品薄层色谱图中a对应色谱带为雌马酚，b对应色谱带可能为染料木苷元，将a、b对应的色谱带进行洗脱和浓缩后进行HPLC检测验证。

图2 尿液样品薄层板色谱图Fig.2 Thin-layer chromatogram of urine sample

2.4 HPLC分析

利用PDA检测器对待测物进行全波长扫描，得到待测物的紫外光谱图，可以辅助HPLC检测结果对物质进行准确定性。因此为了更准确地判断TLC分离效果，在本实验中除了用保留时间对待测物进行归属，还用PDA检测器采集待测物的紫外光谱图，与标准品的光谱图进行对照定性。

图3（A1）和图4（A2）分别为雌马酚和染料木苷元混标的HPLC检测色谱图和PDA检测光谱图，其中雌马酚的保留时间为40.112min，具有224nm和281nm两个特征吸收波长；染料木苷元的保留时间为40.853min，特征吸收波长为259nm。

当未使用TLC处理尿样时，尿液样品的HPLC检测图如图3（B1）所示，在40.362min时出现严重的拖尾峰，说明流动相洗脱效果不佳；使用PDA检测器采集待测物的紫外光谱图并与标准品的光谱图（A2）进行对照发现没有与雌马酚或染料木苷元最大吸收波长和峰型一致的特征吸收峰，说明尿液样品中的雌马酚和染料木苷元未实现有效分离。

将尿液样品经过TLC分离后得到的色谱带a收集物进行HPLC和PDA检测，采集到色谱图（C1）和紫外吸收光谱图（C2），将结果与标准品对比后得到色谱图保留时间基本一致，且具有与雌马酚标准品相同的特征吸收峰和峰型，因此可以证实分离纯化得到的色谱带a收集物即为雌马酚。同理将色谱带b收集物进行检测，得到色谱图（D1）和紫外吸收图谱（D2），与标准品进行比对发现色谱带b收集物与染料木苷元标准品的保留时间基本一致，且特征吸收峰和峰型相同，因此可以证实分离纯化得到的色谱带b收集物即为染料木苷元。

图3 标准品、尿液样品和TLC分离色谱带的色谱图Fig.3 High performance liquid chromatograms of standard，urine sample and chromatographic band

图4 标准品和TLC分离色谱带紫外光谱图Fig.4 Ultraviolet spectrum of standard，urine sample and chromatographic band

3 结论与讨论

利用氯仿∶甲醇（24∶1，v/v）作为TLC展开剂，雌马酚和染料木苷元的分离度（R）为2.4，达到基线分离；后将色谱带a和色谱带b收集物分别进行HPLC和PDA检测后发现，两者分别与雌马酚和染料木苷元的保留时间基本一致，且具有相同的峰型和最大吸收波长，说明通过TLC可以将尿样中雌马酚和染料木苷元基线分离，消除染料木苷元的干扰，实现了雌马酚的有效定性检测，解决了在雌马酚检测过程中由于杂质干扰造成的定性困难的问题，这对准确判定雌马酚生产者有重要意义。

TLC是用于异黄酮分离纯化处理的常用方法，权静等[13]利用氯仿∶甲醇∶乙酸（93∶7∶0.5，v/v/v）作为TLC展开剂成功分离大豆苷元与染料木苷元，说明以氯仿和甲醇为主要成分的展开剂对于大豆异黄酮及其分解产物有较好的分离作用。而Shin-ichiro Yokoyama等[19]利用甲苯∶丙酮（2∶1，v/v）作为TLC展开剂对尿样中的雌马酚进行分离浓缩后进行HPLC检测，并根据检测结果判断受试者是否为雌马酚生产者。而本文在TLC与HPLC相结合的基础上还利用PDA检测器进行辅助定性，使判定结果更加准确可靠。本方法不仅可以用于检测尿液中的雌马酚，还可以用于对菌种发酵液中的雌马酚进行定性检测。

本方法虽然可以对雌马酚进行定性检测，但是还无法实现对雌马酚的准确定量，这主要是由于在色谱带收集过程中存在损失，所以如何利用此方法实现尿液中雌马酚的精确定量检测还有待于在今后实验中继续探索。

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Qualitative detection of urinary equol by thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography

WANG An-yi，CHENG Yong-qiang*，OU Xiao-qun，LIU Xiao-nan，LI Ting，ZHOU Yun
（College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Equol was one of metabolites of daidzin and daidzein by intestinal bacteria decomposition.The disturbance from genistein to equol was reduced by using thin-layer chromatography（TLC）followed by high performance liquid chromatography（HPLC）.This method solved the problem that equol could hardly be separated effectively by HPLC.Developed in a TLC solvent system of chloroform∶methanol（24∶1），equol and genistein were observed on Rfvalue of 0.40 and 0.29，respectively.This new qualitative method for the analysis of urinary equol was more accurate and less disturbed than using only HPLC analysis.

thin-layer chromatography（TLC）；high performance liquid chromatography（HPLC）；equol；genistein

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0079-05

2013－07－17 *通讯联系人

王安易（1992－），女，在读大学本科，研究方向：食品科学。

国家自然科学基金项目（31171739）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B03）；北京市大学生创新创业训练项目；教育部新世纪优秀人才支持计划（NETC-10-0776）项目；北京市优秀人才培养资助计划（2011D009007000001）。