新疆特色维药瘤果黑种草籽的抗氧化活性研究

于明，刘玲玲，徐鑫，吴新风

（新疆农业科学院粮食作物研究所加工研究室，新疆乌鲁木齐830091）

新疆特色维药瘤果黑种草籽的抗氧化活性研究

于明，刘玲玲，徐鑫，吴新风

（新疆农业科学院粮食作物研究所加工研究室，新疆乌鲁木齐830091）

以不同极性溶剂分别对瘤果黑种草籽进行提取，得到甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、正己烷提取物，并采用二苯代苦味酰基自由基（DPPH），2,2'-连氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）和还原能力三种不同的实验方法评价新疆瘤果黑种草籽抗氧化活性。结果表明，瘤果黑种草籽提取物具有不同程度的抗氧化能力，甲醇提取物的抗氧化活性相对优于其它溶剂萃取物，清除DPPH自由基的能力优于BHT，瘤果黑种草籽各溶剂提取物具有较强ABTS清除能力，最高清除率达81.33%，其ABTS自由基清除率强弱顺序为甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物；黑种草籽提取物还原能力强弱顺序为甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物。瘤果黑种草籽提取物具有很好的抗氧化活性，不同溶剂提取物对抗氧化活性有很大影响。

瘤果黑种草籽；溶剂萃取；抗氧化活性

黑种草属毛茛科（Ranuncualceac）金莲花亚科黑种草属（Nigella）植物，目前作为药用的有3种，分别是瘤果黑种草（Nigella glanduliferaFreyn），又名腺毛黑种草；果黑种草（Nigella sativa），又名家黑种草以及黑种草（Nigella damascene）[1]。瘤果黑种草主产地新疆，是新疆特有的植物资源，为我国新疆维吾尔族常用药材[2]。药用部位一般为种子，维吾尔族名为斯亚旦，瘤果黑种草籽已作为维药材收入《中华人民共和国药典》和《中国民族药志》[3]。在维吾尔医药中，黑种草具有利尿、补脑、补肾、活血、解毒、下乳、通经、止咳、乌发、抗衰老等作用[4]，研究表明其具有抗菌，抗肿瘤的功效，近年来研究发现瘤果黑种草籽可以预防支气管疾病，加强免疫力，降血压和镇痉剂（止痉挛）等[5-8]。另外，瘤果黑种籽草富含多种有效成分，具有独特的芳香味并含有丰富的脂肪酸和挥发性精油，维吾尔族群众常用瘤果黑种草种籽作为焙烤面点的调味品[9]。目前国内外对于瘤果黑种草籽的化学成分和药理作用研究较多，而对于其抗氧化能力的评价相对较少[10-11]。本研究采用三种不同抗氧化实验对瘤果黑种草籽溶剂提取物的抗氧化活性进行评价，旨在为瘤果黑种草籽的药用机理研究以及今后天然抗氧化剂的开发合成及应用奠定基础，从而为更好的开发利用新疆特有药食两用植物资源提供坚实的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

瘤果黑种草籽：新疆维吾尔民族医药市场；2,6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、抗坏血酸（vitaminC，VC）：上海源叶生物科技有限公司；乙醇、过硫酸钾、铁氰化钾：天津市登科化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。二苯代苦味酰基自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）；2,2’连氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）：美国阿拉丁试剂公司。

1.2 仪器与设备

FA2004N型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；DZTW型调温电热套、SHB-ⅢS循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FW80粉碎机：北京市永光明医疗仪器厂；RE-5298A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；JOYN-SXT-06索氏提取器、HH-S1恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；L6S紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；LD4-2离心机：北京医用离心机厂。

1.3 实验方法

1.3.1 瘤果黑种草籽溶剂萃取物的制备

采用三种不同极性的有机溶剂甲醇、乙酸乙酯、正己烷进行索氏提取，分别称取25 g瘤果黑种草籽粉末于500 mL圆底烧瓶中，加入300 mL不同极性的有机溶剂后加热回流提取4 h，反复3～5次，合并回收有机溶剂，用旋转蒸发仪浓缩提取物，制得浸膏，备用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照文献方法[12]，用无水乙醇配制成0.02 mmol/L的DPPH标准溶液，将样品用乙醇配制成一系列质量浓度（0.2～1.0 mg/mL），取2.0 mL样品于试管中，并加入2.0 mL DPPH乙醇溶液，用2 mL乙醇作为空白对照组代替样品，25℃水浴加热30 min后，在波长515 nm处测定吸光度值。以BHT和VC作为参照品，每组实验平行测三次，取平均值。DPPH自由基清除率计算公式：

DPPH自由基清除率=[（AControl-ASample）/AControl]×100%

式中：AControl为2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL乙醇混合后的吸光度值；ASample为2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL样品混合后的吸光度值。

1.3.3 ABTS自由基清除能力的测定

参照文献[13]将ABTS用去离子水配制成7 mmol/L的自由基准备液，然后往准备液中加入过硫酸钾固体，使此准备液的过硫酸钾浓度变为2.45 mmol/L，室温避光保存12～16 h。实验时用无水乙醇将ABTS储备液在734 nm处稀释到吸光度值在0.7±0.02区间内。取0.15 mL质量浓度在0.125～2.000 mg/mL的样品于试管中，加入2.85 mL ABTS自由基工作液，充分混匀，放置10 min后，在734 nm处测定吸光度值。以BHT和VC作为参照品，每份样品平行操作三次。ABTS自由基清除率计算公式：

ABTS自由基清除率=[（AControl-ASample）/AControl]×100%

式中：AControl为0.15 mL ABTS溶液与2.85 mL无水乙醇混合后的吸光度值；ASample为0.15 mL样品与2.85 mL ABTS溶液混合后的吸光度值。

1.3.4 还原能力的测定

参照文献方法[14]，其原理为样品能将Fe3+还原为Fe2+来评价其还原能力。取不同浓度样品溶液2.5 mL，分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（0.2 mol/mL，pH=6.8），2.5 mL质量分数1%铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]），在50℃水浴恒温反应20 min后快速冷却，加入三氯乙酸溶液2.5 mL摇匀，于4 000 r/min离心10 min，取出上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水和质量分数为0.1%FeCl3溶液0.5 mL，混匀后静置10 min，在波长700 nm下测定吸光度值。以蒸馏水作为参比溶液，同时用BHT和VC作对比实验，每组实验重复三次，取平均值。吸光值越大，则样品的还原能力越大。还原能力计算公式：

还原能力=ASample-AControl

式中：ASample为样品的吸光度值，AControl为空白液的吸光度值。

1.3.5 半数抑制率的计算

半数抑制率（50%inhibitive concentration，IC50）指清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度，根据不同浓度抗氧化剂的清除率作曲线求出。IC50越小，抗氧化活性越强。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力的测定

不同溶剂提取物DPPH自由基清除率（Y）与各溶剂提取物质量浓度（X）的关系见表1，不同溶剂提取物对DPPH自由基清除率见图1。

表1 不同溶剂萃取物质量浓度与DPPH自由基的清除率的关系Table 1 Relationship between different solvent extracts concentration and DPPH scavenging capacity

图1 不同溶剂提取物对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of different solvent extracts on DPPH radical scavenging capacity

由表1及图1可知，按照IC50值，瘤果黑种草籽不同溶剂萃取物与BHT、VC对DPPH自由基的清除能力由强到弱依次为VC＞甲醇提取物＞BHT＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物。瘤果黑种草籽提取物中极性溶剂甲醇的清除自由基的活性最强，且甲醇提取物的清除活性大于对照品BHT的清除活性，但低于VC的清除活性。结果表明，提取物的质量浓度越大，DPPH自由基的清除率越高。

2.2 ABTS自由基清除能力的测定

不同溶剂萃取物对ABTS自由基的清除作用结果见图2。由图2可知，不同溶剂萃取物随质量浓度的增加对ABTS自由基的清除作用增强。不同溶剂萃取物对ABTS自由基的清除能力由强到弱为VC＞BHT＞甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正已烷提取物。当提取物质量浓度达到2 mg/mL时，3种溶剂提取物的ABTS自由基清除率分别为81.33%、38.16%、33.89%，甲醇提取物表现出了很强的ABTS自由基清除率，但是低于对照VC及BHT。

图2 不同溶剂提取物对ABTS自由基清除率的影响Fig.2 Effect of different solvent extracts on ABTS radical scavenging capacity

2.3 还原能力的测定

不同提取物还原能力测定结果见图3。由图3可知，随着瘤果黑种草籽提取物质量浓度的增加，还原力刚开始迅速增加，随后增长趋于平缓。还原能力是其抗氧化活性的重要指标，一般物质的还原能力越强，其抗氧化活性也越强[15]。由图3可知，不同提取物的还原能力均与其质量浓度呈现出正相关性，即质量浓度越大，还原能力越强。不同提取物还原能力由强到弱依次为VC＞BHT＞甲醇提取物＞正己烷提取物＞乙酸乙酯提取物。

图3 不同溶剂提取物对还原能力的影响Fig.3 Effect of different solvent extracts on reducing capacity

3 结论

通过新疆瘤果黑种草籽不同溶剂提取物的三种抗氧化能力的试验，并与人工合成的抗氧化剂BHT和VC进行相比较得出，3种提取物均具有一定的的清除DPPH自由基的能力，其中甲醇提取物的清除活性高于BHT，但是低于对照VC。对ABTS自由基的清除活性也表明，甲醇提取物的清除率最高达到81.33%，但是低于对照VC及BHT。甲醇提取物在还原能力实验中甲醇提取物也表现出一定的抗氧化活性。

不同溶剂提取物抗氧化能力不同，这可能是由于不同溶剂极性强弱不同，所萃取的萃取物成分不同，其所含抗氧化物质的总量和结构也不同，故在不同的抗氧化体系中，其抗氧化作用也不同。结果表明，新疆瘤果黑种草籽提取物具有一定的的抗氧化活性，可以作为一种天然抗氧化剂进行深层次开发利用。

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Antioxidant activity of Xinjiang Uighur medicineNigella sativaL.seeds

YU Ming,LIU Lingling,XU Xin,WU Xinfeng
(Research Institute of Cereal Crop,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China)

TheNigella sativaL.seeds were extracted by different polar solvent of methanol,ethyl acetate and hexane,and the antioxidant activities of the samples were evaluated by three different test systems,DPPH,ABTS and reducing capacity.Result showed thatN.sativaL.seeds extract showed different antioxidant activity,the antioxidant of methanol extract was significantly stronger than the others,and the scavenging DPPH radicals activity was superior to BHT.All extracts had stronger ABTS scavenging activities;the highest scavenging rate was up to 81.33%.The ABTS free radical scavenging activity and reducing capacity in order was methanol extract,ethyl acetate extract,hexane extract.The results suggested that the seeds extract exhibited strong antioxidant activity,and different polar solvent had strong effect on antioxidant activity.

Nigella sativaL.seeds;solvent extract;antioxidant activity

R29

A

0254-5071（2014）11-0110-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.025

2014-09-23

新疆科技兴新项目（2012017B10）

于明（1973-），男，副研究员，硕士，主要从事新疆特色农产品开发研究。