白酒发酵副产物黄水中两株产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定

袁春红，宋菲菲，林凯，向文良，张庆

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

白酒发酵副产物黄水中两株产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定

袁春红，宋菲菲，林凯，向文良，张庆*

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

利用羧甲基纤维钠（CMCNa）平板筛选法，从白酒发酵副产物黄水中分离得到12株产纤维素酶菌株，其中菌株M34和菌株N2的比酶活最大，被选为后续研究对象。根据细菌形态特征观察，生理生化特性分析并结合16S rRNA序列分析，鉴定菌株M34和菌株N2分别为环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）和内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）。菌株经液态发酵培养，运用DNS法测定纤维素酶系酶活力，结果表明菌株N2的各酶活均高于菌株M34，其羧甲基纤维素酶活为0.132 U/mL，微晶纤维素酶活为0.012 U/mL，滤纸酶活为0.041 U/mL，β-葡萄糖苷酶活为0.158 U/mL。

黄水；纤维素酶；筛选；鉴定；酶活

纤维素酶是一类诱导型多酶复合体，通常由内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶3种具有不同催化反应功能的酶组成，几种酶协同作用催化纤维素水解为葡萄糖[1]。目前，纤维素酶已在发酵工业、造纸工业、纺织工业、日用化工、废水处理、动物食料的加工等各个领域得到了应用，其前景十分广阔。在白酒酿造过程中，纤维素酶对原料中的纤维素进行降解，破坏间质细胞壁的结构，使其包含的淀粉释放出来，以利于糖化酶的作用，从而起到提高原料利用率、提高发酵率和缩短发酵时间的效果[2]。可以产生纤维素酶的微生物包括真菌、细菌、放线菌以及部分古菌和酵母菌[3]。但目前大多数研究主要集中于真菌，鉴于细菌繁殖和产酶速度快、发酵周期短，有利于工业化生产，近年来关于细菌特别是极端环境中筛选到细菌产纤维素酶的研究也越来越受到重视[6]。

黄水是中国传统白酒酿造过程中的副产物，含有大量的有机酸、醇、醛、酯等呈香呈味物质，还有氨基酸、糖类、腐殖质及菌体细胞等，其pH值为2.5～4.0，构成了极端复杂的微生物生长环境[7]。迄今为止，关于筛选产纤维素酶菌株的报道大多限于从土壤、粪便、水体中分离的菌株，未见有从黄水中筛选产纤维素酶菌株的报道[8]。本研究从白酒发酵副产物黄水中筛选出了产纤维素酶能力较强的细菌，并对其形态、生理生化特征、16S rRNA序列及纤维素酶系活力进行初步分析，为窖池中黄水的再次发酵回用，以促进原料中纤维素的水解、提高发酵效率等生产应用提供了理论基础，也为纤维素酶的研究提供新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄水样品：四川水井坊提供；麸皮：成都当地菜市场市售；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMCNa）（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；Kovacs氏试剂盒、硝酸盐还原试剂盒：青岛海博生物技术有限公司；TaKaRa聚合酶、DH5α感受态细胞：TaKaRa Biotechnology（大连）；pGM-T试剂盒、MarkerⅦ：天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒：OMEGA公司；Whatman NO.1滤纸：Whatman公司；D-（-）水杨苷（纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司；微晶纤维素（化学纯）、3,5-二硝基水杨酸（化学纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

AllegraX-15R冷冻离心机：贝克曼库尔特公司；720BR/ 01492电泳凝胶成像分析系统、BiometraT1PCR仪：BIO-RAD公司；SGSP-02恒温培养箱：黄石恒丰器械有限公司；ZHWY空气浴恒温振荡器：上海智诚分析仪器制造有限公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；WFJ-7200可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的分离与纯化

取1 mL黄水用生理盐水进行梯度稀释，每个梯度取0.1 mL涂布于营养肉汤培养基，37℃培养18 h，挑取单个菌落进行反复划线纯化，将纯化的菌种编号、保存。

1.3.2 纤维素酶产生菌的筛选

将纯化后的菌株点接于筛选培养基，37℃培养2d，然后向培养平板上加入适量碘液染色2 min[10]。若菌株周围有透明水解圈出现，则说明该菌株产生纤维素酶。测量透明水解圈与菌落直径的比值，初步确定菌株的纤维素酶活性高低。

1.3.3 菌落形态及生理生化特征

具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》。

1.3.4 菌株的DNA提取及16S rRNA分析

将纯化后培养的菌株，按照A.E.Z.N.A.TM DNA Kit Protocol（America，OMEGA）提取总DNA，作为后续16S rRNA序列扩增反应模板。PCR扩增体系组成为：5 μL 10× PCRReactionBuffer，4 μLdNTP，0.5μLTaq聚合酶，37.5μL ddH2O，引物Eu27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1490R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）各1 μL（10 pmol/μL），1 μL总DNA模板。PCR扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min完成35个循环，72℃延伸10min。参照pGEM-TEasyVector System I（Promega USA）说明将PCR产物连接至pGEM-T载体，并转化至感受态细胞E.coliDH5α中，涂布于含腺苷-磷酸（adenosinemonophosphate，Amp）（100 μg/mL）、异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside，IPTG）（24μg/mL）和X-gal（40μg/mL）的LB平板上，筛选阳性克隆子。按照Plasmid Mini Kit I（OMEGA USA）说明提取重组质粒并测序。测序结果经NCBI中的Blast分析比对后，再通过Clustal X 1.8软件进行全序列比对，利用MEGA 4.0软件以NeighBor-Joining法进行1 000次步长计算构建系统发育树[11]。

1.3.5 酶系活性测定[13]

接种2%菌液（～×107CFU/mL）于发酵培养基中，37℃，180 r/min培养3 d。培养液经8 000×g离心20 min，得到上清液，即为粗酶液。取适当稀释的粗酶液1 mL加入用缓冲液（pH 7）配置的反应底物1 mL，混匀，置于50℃条件下保温一定时间，加入2 mL的DNS反应液终止反应，并在沸水浴中反应10 min，冷却，在波长540 nm处测定吸光度值。根据标准曲线、稀释倍数、反应时间计算酶活大小。

酶活力定义：每毫升样液每分钟水解纤维素底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以U/mL表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

图1 纤维素降解菌平板筛选Fig.1 Screening plate for cellulose-decomposing strains

表1 筛选平板上12株细菌的菌落直径和透明圈直径Table 1 Colony diameter and transparent circle diameter of 12 strains on screening plate

黄水中的细菌经CMC平板初步筛选，共获得12株能水解纤维素的菌株，见图1。比酶活测定结果见表1，从表1可看出，菌株M34、N2的比酶活最大。纤维素分解菌能分泌纤维素酶而将菌落周围的纤维素降解成小分子的低聚糖及纤维二糖、葡萄糖等，而培养基中未被水解的纤维素和革兰氏碘液可形成棕色复合物，故在纤维素培养基上，纤维素分解菌的菌落周围能形成透明的水解圈，且水解圈的大小同酶活性的高低有一定的数量关系。因此，菌株M34、N2被选为后续试验菌株。

2.2 菌株的形态及生理生化特征

菌株M34及菌株N2的形态特征结果见图2。菌株M34在筛选平板上表现出透明，乳白，不规则，边缘不整齐的形态；菌株N2在筛选平板上菌落形态为：不透明，白色，圆形，扁平，边缘不整齐，不黏稠。通过革兰氏染色，油镜观察发现这两株菌株均为革兰氏阳性菌，形态为杆状并具有芽孢。菌株生理生化特征分析见表2。

图2 菌株M34（A）及N2（B）菌落形态Fig.2 Colony morphology of strains M34（A）and N2（B）

表2 菌株M34、N2部分生理生化特征Table 2 Partly biochemical and physiological characteristics of strains M34 and N2

由表2可知，菌株M34可以利用多种糖，两种菌株多项生理生化反应呈阴性，但在一定的NaCl浓度和pH范围内可以生长。

2.3 菌株的16S rRNA分析

将测序得到的序列在NCBI上完成BLAST，用Clustal X软件与GenBank中的相关序列进行同源性比对，用MEGA 4.0软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果见图3。由图3结果可知，菌株M34与Bacillus circulans的亲缘关系最近，与标准菌株Bacillus circulansATCC 4513相似度为99%；菌株N2与Bacillus endophyticus亲缘关系最近，与Bacillus endophyticusMDSR34相似度为99%。BOSSHARD P P[14]认为相似度大于99%的细菌判定为同种细菌，相似度介于95%～99%之间则判定为同属，相似度在91%～95%之间判定为同科。因此，由16S rRNA分析结果，结合菌落形态特征及生理生化特性分析，鉴定M34和N2菌株分别为环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）和内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）。

图3 基于16S rRNA序列同源性的菌株N2及M34系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strains N2 and M34 based on homology of 16S rRNA sequences

2.4 菌株纤维素酶系活性测定

表3 酶活测定结果Table 3 Determination results of enzyme activity

将纤维素降解为葡萄糖是纤维素酶系共同作用的结果，分别以羧甲基纤维素钠（CMCNa）、D-水杨苷、滤纸、微晶纤维素为唯一作用底物，并测定菌株M34和N2的内切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、外切型葡萄糖苷酶（微晶纤维素酶）、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶的酶活。结果如表3所示，菌株M34产生的纤维素酶系对羧甲基纤维素钠表现出最高的降解活性（0.061 U/mL），即菌株N2产生的纤维素酶系对D-水杨苷表现出最高的降解活性（0.158 U/mL），也就是说，菌株M34产生的纤维素酶系中内切型葡聚糖苷酶活性最高，菌株N2产生的纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶活性最高。本研究获得的菌株M34、N2分离自一种低氧、强酸性、营养匮乏的极端环境，它们产生的酶也可能在极端的环境下具有某些特殊性能。目前本研究只是对它们的产酶情况进行初步的了解，下一步将进一步优化培养基、培养条件以期在提高其纤维素酶系活性的同时了解他们的最佳产酶条件，为进一步探讨其在白酒酿造过程中的动态变化及对纤维质原料的利用情况，及其是否可应用于窖池中黄水的再次发酵回用等问题奠定理论基础。

3 结论

纤维素酶由于其广泛的应用领域及良好的应用前景一直受到人们的关注，筛选产生该酶的新菌株、高产菌株，诱变选育该酶的高产菌株，克隆产生该酶的基因，以及对该酶进行蛋白质工程方向的研究一直都在进行[15]。黄水中的大部分物质对提高白酒质量，增加白酒香气，改善白酒风味有着重要的作用，目前许多对黄水的研究主要集中于黄水中化学成分分析，而对其中的微生物及其产生的活性代谢产物的研究却未见报道[19]。本研究从低氧、高酸度、营养匮乏的黄水环境中分离的2株产纤维素酶菌株M34和N2进行鉴定。经形态观察、理化分析及分子生物学特征鉴定菌株M34和N2分别为环状芽孢杆菌（Bacillus circulaulns）和内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus），而有关该两株菌来源的纤维素酶还未见报道。酶活测定结果表明菌株N2的纤维素酶系活力均高于菌株M34，且其中β-葡萄糖苷酶的酶活最高，为0.158U/mL。本研究首次对黄水中产纤维素酶细菌进行了报道，为黄水中微生物系统的研究提供一定的理论指导，为今后细菌纤维素酶的研究提供了新的种质资源，也对拓展纤维素酶的种质来源具有着积极的意义。

[1]许志，曾柏泉，宋睿.高产纤维素酶菌株筛选及诱变选育[J].中国农学通报，2011，27（24）：108-111.

[2]李旭晖，吴生文，张志刚.纤维素酶对大曲酒风味物质影响的探讨[J].中国酿造，2011，30（6）：80-83.

[3]李燕红，赵辅昆.纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005，17（5）：392-397.

[4]ANDO S,ISHIDA H,KOSUGI Y,et al.Hyperthermostable endoglucanase fromPyrococcus horikoshii[J].Appl Environ Microb,2002,68 (1):430-433.

[5]KASHIMA Y,UDAKA S.High-level production of hyperthermophilic cellulase in theBacillus brevisexpression and secretion system[J].Biosci Biotech Bioch,2004,68(1):235-237.

[6]燕红，杨谦，王希国.两株芽孢杆菌产纤维素酶的研究[J].林产化学与工业，2006，26（2）：83-86.

[7]彭佑信.论浓香型白酒生产中的黄水[J].酿酒，2009，36（1）：37-39.

[8]杨柳，魏兆军，朱武军，等.产纤维素酶菌株的分离、鉴定及其酶学性质研究[J].微生物学杂志，2008，28（4）：65-69.

[9]李琦，刘伍生，刘正初.不同地点筛选纤维素酶产生菌的研究进展[J].中国农学通报，2012，28（33）：194-198.

[10]RAMESH C K,CHAND K,RICHA S,et al.A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine[J].Curr Microbiol,2008,57:503-507.

[11]THOMPSON J D,GIBSON T J,PLEWNIAK F,et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997,25(24): 4876-4882.

[12]KUMAR S K,TAMURA I,NEI M,et al.MEGA3:integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinform,2004,5(2):150-163.

[13]GANESH D S,RIJUTA G S,SANG E O.Production and characterization of multiple cellulolytic enzymes by isolatedStreptomycessp.MDS [J].Biomass Bioenergy,2012(47):301-315.

[14]BOSSHARD P P,ABELS S,ZBINDEN R,et al.Ribosomal DNA sequencing for identi cation of aerobic gram-positive rods in the clinical laboratory(an18-monthevaluation)[J].J Clin Microbiol,2003,41(9): 4114-4140.

[15]RAMALINGAM K,RAMASAMY G.Isolation,screening and characterization of cellulase producingBacillus subtilisKG10 from virgin forest of Kovai Kutralam,Coimbatore,India[J].Res J Biotechnol,2013,8 (6):17-24.

[16]许志，曾柏全，宋睿.高产纤维素酶菌株筛选及诱变选育[J].中国农学通报，2011，27（24）：108-111.

[17]CHENG S J,YANG P Z,GUO L Q,et al.Expression of multi-functional cellulase genemfcinCoprinuscinereusunder control of different basidiomycete promoters[J].Bioresource Technol,2009,100(19):4475-4480.

[18]LEE Y,KIM B,LEE B,et al.Purification and characterization of cellulase produced byBacillus amyoliquefaciensDL-3 utilizing rice hull[J]. Bioresource Technol,2008,99(2):378-386.

[19]曹新莉，王明山.白酒生产中黄水和酒尾的应用[J].酿酒科技，2008（10）：96-99.

[20]彭太升.黄水调酒液在浓香型白酒中的应用[J].酿酒，2011，38（6）：36-37.

[21]王传荣，沈洪涛.黄水在新型白酒生产中的应用[J].中国酿造，2005，24（2）：26-28.

Isolation and identification of two cellulase-producingBacillusspp.from the by-product of Huangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation

YUAN Chunhong,SONG Feifei,LIN Kai,XIANG Wenliang,ZHANG Qing*
(College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

12 bacteria with cellulase-producing capacity were isolated from the by-product ofHuangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation by carboxymethyl cellulose(CMC)plate screening method.Two strains named M34 and N2 with high specific enzyme activity were chosen as the follow-up test object.According to their morphology features,biochemical and physiological characteristics and 16S rRNA sequence analysis, strain M34 was identified asBacillus circulansand strain N2 was identified asBacillus endophyticus.Both strains cellulase activities were detected byDNSmethod and the resultsshowed thatthe enzyme activityofstrain N2 washigher than M34.Among the enzyme activityof strain N2,the CMCase activity was 0.132 U/ml,the avicellulase activity was 0.012 U/ml,the FPase activity was 0.041 U/ml and theβ-glucosidase activity was 0.158 U/ml.

Huangshui(fermented mash);cellulase;screening;identification;enzyme activity

Q93-33、Q815

A

0254-5071（2014）11-0090-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.020

2014-09-19

西华大学“西华杯”大学生科技创新项目（No：2014135）

袁春红（1989-），女，硕士研究生，研究方向食品生物技术。

*通讯作者：张庆（1979-），男，讲师，博士，研究方向为食品微生物技术。