玉米浆中金属离子对三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的影响

向梦雄，闫兴，王常高，杜馨，林建国，蔡俊

（发酵工程教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068）

玉米浆中金属离子对三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的影响

向梦雄，闫兴，王常高，杜馨，林建国，蔡俊*

（发酵工程教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068）

玉米浆是玉米淀粉生产加工所得的副产物，其含有蛋白质、维生素、氨基酸等营养成分，被广泛应用于微生物发酵生产中，但由于玉米浆包含有多种金属离子，可能会影响微生物发酵生产的过程。本研究通过单因素试验法分别采用FeCl3、MnSO4、ZnSO4、CuSO4和CaCl2模拟玉米浆中存在的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+的不同质量分数，研究了玉米浆中存在的部分金属离子对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素的影响，研究发现一定浓度的Zn2+或Mn2+对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素有促进作用；而不同浓度的Fe3+，Cu2+和Ca2+对β-胡萝卜素合成存在抑制作用。本研究对以玉米浆为原料采用三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素有一定的指导。

玉米浆；β-胡萝卜素；三孢布拉氏霉菌；金属离子

β-胡萝卜素（β-carotene）是类胡萝卜素的一种，也是一种橘黄色脂溶性化合物，广泛存在于高等植物中（如绿色蔬菜、胡萝卜、水果等）。一分子β-胡萝卜素理论上可以从中心断开转化为两分子视黄醇（维生素A），故其又常被称为维生素A原。β-胡萝卜素广泛应用于医学与食品领域，在医学领域中作为一种高效的生理抗氧化剂，能够用来抗肿瘤、抗衰老等，在食品领域里由于其无毒无害且着色能力良好被广泛作为食品着色剂[1-3]。天然β-胡萝卜素的生产方法主要有天然植物提取、盐藻萃取和微生物发酵生产三种，由于微生物发酵生产β-胡萝卜素不受环境条件的限制而被广泛采用，目前工业上多采用三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素，与其他菌种相比具有单位菌体量色素产量高、生物量较大的优点[4-7]。

玉米浆是玉米淀粉生产加工所得的最重要的副产物之一，其组成较为复杂，包含有蛋白质、维生素、氨基酸和各种金属离子等多种物质，由于玉米浆包含丰富的营养成分，所以被广泛应用于微生物发酵生产中[8]。目前，工业发酵中主要以三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素，但由于其培养基成分较为复杂，导致成本过高[9]，如果能以玉米浆为原料将可大大降低成本。玉米浆中的多种金属离子如Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+等可能对三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素有不同的影响，本研究以三孢布拉霉正负菌为生产菌株，采用单因素实验探究不同金属离子对β-胡萝卜素合成的影响，以期为利用玉米浆生产β-胡萝卜素提供一定指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

三孢布拉氏霉菌（Blakesleatrispora）：正菌ATCC14271，负菌ATCC 14272均由本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂

β-胡萝卜素：荷兰DSM公司；玉米浆：山东潍坊盛泰药业有限公司；其他试剂均为分析纯，购于上海国药集团。

1.1.3 培养基（以质量分数计）

斜面培养基：新鲜去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然；

种子培养基：大豆粉3%，玉米粉3%，KH2PO40.1%，MgSO40.02%，VB10.001%，pH 6.5；

发酵培养基：葡萄糖9%，麸皮浸出液4%，大豆粉0.3%，大豆油1%，KH2PO40.1%，MgSO40.02%，VB10.001%，pH 6.5。

1.2 仪器与设备

GW-2000型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；ZHWY系列双层恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培养

三孢布拉霉正负菌分别接种至斜面培养基，28℃培养5 d。

1.3.2 种子培养

正负菌各取一环孢子接种至种子培养基中，种子培养基装于250 mL三角瓶中，装液量为50 mL，培养温度28℃，摇床转速200 r/min，正负菌培养时间分别为20 h和25 h。

1.3.3 发酵培养

将生长至对数期的正负菌株以1∶9的比例按6%的接种量接种至发酵培养基中，在培养温度为28℃，摇床转速180 r/min的条件下振荡培养120 h。

1.3.4 生物量的测定

将发酵结束的发酵液用双层纱布过滤，清水冲洗后，放置于真空干燥箱中50℃烘干至恒质量。

菌体生物量的计算公式如下：

菌体生物量（g/L）=（M1-M2）×20

式中：M1表示烘干后菌体和纱布质量，g；M2表示纱布质量，g；20表示将生物量单位由g/50 mL换算成g/L。

1.3.5 β-胡萝卜素含量的测定

将真空干燥后所得干菌体，用研磨法粉碎细胞并过60～80目筛。精确称取0.01 g的菌丝体粉末，将称取的粉末加入50 mL石油醚避光萃取至无色，将萃取液稀释至适当倍数在波长450 nm下用分光光度计测定其吸光度值，并依据标准曲线回归方程计算出菌丝体中β-胡萝卜素含量。

1.3.6 β-胡萝卜素标准曲线的绘制

精确称取50 mgβ-胡萝卜素标准样品，用石油醚溶解定容至50 mL，吸取1.0 mL此溶液加石油醚定容至100 mL，可得10 μg/mLβ-胡萝卜素标准液。分别吸取10 μg/mL的β-胡萝卜素标准液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL，用石油醚定容至25mL，得到质量浓度梯度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0 μg/mL、1.2 μg/mL、1.4 μg/mL、1.6 μg/mL的β-胡萝卜素标准溶液，采用分光光度计在波长450 nm处，以石油醚为空白溶液分别测定各梯度标准液吸光度值，以吸光度值（y）为纵坐标，标准溶液质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，并得到回归方程。

1.3.7 不同金属离子对三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的影响

经过分析得到玉米浆中各组分含量，其中Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+的质量浓度分别为396 mg/kg、28.8mg/kg、61mg/kg、0.18mg/kg、3500mg/kg、15200mg/kg和440 mg/kg。玉米浆中Mg2+、K+是三孢布拉氏霉菌生长所必需的，但Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+等离子可能会对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素有影响。

（1）Fe3+对β-胡萝卜素合成的影响

采用单因素实验法考察Fe3+对三孢布拉氏霉菌发酵的影响，玉米浆中Fe3+质量分数为396 mg/kg。采用FeCl3模拟玉米浆中铁离子浓度，Fe3+含量分别选取100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg、500 mg/kg，发酵120 h后测定β-胡萝卜素的产量和生物量。每个实验三个平行。

（2）Mn2+对β-胡萝卜素合成的影响

采用单因素实验法考察Mn2+对三孢布拉氏霉菌发酵的影响，玉米浆中Mn2+含量为28.8 mg/kg。采用MnSO4模拟玉米浆中锰离子含量，Mn2+含量分别选取10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg、90 mg/kg。发酵120 h后测定β-胡萝卜素的产量和生物量。每个实验三个平行。

（3）Zn2+对β-胡萝卜素合成的影响

采用单因素实验法考察Zn2+对三孢布拉氏霉菌发酵的影响，玉米浆中Zn2+含量为61 mg/kg。采用ZnSO4模拟玉米浆中锌离子含量，Zn2+含量分别选取20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg、100 mg/kg，发酵120 h后测定β-胡萝卜素的产量和生物量。每个实验三个平行。

（4）Cu2+对β-胡萝卜素合成的影响

采用单因素实验法考察Cu2+对三孢布拉氏霉菌发酵的影响，玉米浆中Cu2+含量为0.18 mg/kg。采用CuSO4模拟玉米浆中铜离子含量，Cu2+含量分别选取0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg，发酵120 h后测定β-胡萝卜素的产量和生物量。每个实验三个平行。

（5）Ca2+对β-胡萝卜素合成的影响

采用单因素实验法考察Ca2+对三孢布拉氏霉菌发酵的影响，玉米浆中Ca2+含量为440mg/kg。采用CaCl2模拟玉米浆中钙离子含量，Ca2+含量分别选取200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg、1 000 mg/kg，发酵120 h后测定β-胡萝卜素的产量和生物量。每个实验三个平行。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素标准曲线的绘制

采用β-胡萝卜素标准样品绘制标准曲线，结果见图1。由图1可知，对标准曲线进行线性回归，得到回归方程为y=0.257x+0.005，R2=0.998，表明二者线性相关性较好。

图1 β-胡萝卜素标准曲线Fig.1 Standard curve ofβ-carotene

2.2 Fe3+对β-胡萝卜素合成的影响

不同Fe3+质量分数对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响结果见图2。从图2可知，加入Fe3+会抑制β-胡萝卜素产的合成，并且随着Fe3+含量的增加，Fe3+对β-胡萝卜素的抑制作用越强，特别是当Fe3+的含量达到500 mg/kg时，β-胡萝卜素的含量为（26.51±0.51）mg/L，较空白组下降了29.11%。不同Fe3+浓度对菌体生物量影响不显著。

图2 不同Fe3+质量分数对β-胡萝卜素含量及生物量的影响Fig.2 Effects of different concentration of Fe3+onβ-carotene and biomass

培养基中添加Fe3+抑制β-胡萝卜素合成可能是过量Fe3+的加入加强了菌体中的氧化应激反应从而导致了β-胡萝卜素产量的急剧减少，同时过量的Fe3+降低甲羟戊酸激酶的活性，甲羟戊酸激酶酶活的降低导致甲羟戊酸转化5-磷酸甲羟戊酸的减少，进而降低了β-胡萝卜素的合成[10-11]。

2.3 Mn2+对β-胡萝卜素合成的影响

不同Mn2+质量分数对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响结果见图3。由图3可知，添加适量的Mn2+会刺激色素的合成。当培养基中Mn2+质量分数增加到50 mg/kg时菌体生物量达到最大，但菌体色素最大量是在Mn2+质量分数为70mg/kg时，此时β-胡萝卜素含量为（63.91±1.92）mg/L，相比空白提高了51.06%。生物量随着Mn2+质量分数的增加呈现先增后减的趋势，其中除了Mn2+含量为50 mg/kg时菌体生物量是高于空白，其他组菌体生物量都是低于空白的，这说明过高或过低的Mn2+对菌体的生长都有抑制作用。当添加不同质量分数Mn2+时，菌体的β-胡萝卜素的含量基本都是高于空白组，说明在一定质量分数范围内Mn2+对β-胡萝卜素的合成有促进作用。

图3 不同Mn2+质量分数对β-胡萝卜素含量及生物量的影响Fig.3 Effects of different concentration of Mn2+onβ-carotene and biomass

Mn2+可以使黑曲霉细胞壁的成分发生改变或使细菌细胞通透性发生改变[12]，由此可推断Mn2+对三孢布拉氏霉菌生物量影响的主要原因可能是Mn2+造成了细胞表面的组成的改变，对菌体生物量产生了影响，并通过增加细胞膜的通透性使细胞可以更好吸收营养物质，促进了β-胡萝卜素的合成。Mn2+的加入可能也提高了参与次级代谢的酰基激酶和酰基辅酶A（Coenzyme A，CoA）合成酶的活性，导致形成更多的乙酰CoA，这也就促进了β-胡萝卜素的合成[13]。

2.4 Zn2+对β-胡萝卜素合成的影响

不同Zn2+质量分数对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响结果见图4。从图4可知，依次向发酵培养基中添加不同含量Zn2+基本都能够促进β-胡萝卜素的合成，当培养基中Zn2+的含量达到60mg/kg时，β-胡萝卜素的含量达到最大，色素含量相比空白提高了17.86%，达到（61.32±2.01）mg/L，加入不同质量分数Zn2+对菌体的生物量影响并不显著。

添加低质量分数的Zn2+，能够显著提高色素的合成，其原因可能是Zn2+是糖酵解关键酶的辅助因子，适量的Zn2+会提高一些锌酶的活性，进而对细胞代谢起到促进作用，而过量的Zn2+对细胞存在毒害作用导致细胞活性降低，因而β-胡萝卜素的产量略微有所下降[14]。

图4 不同Zn2+质量分数对β-胡萝卜素含量及生物量的影响Fig.4 Effects of different concentration of Zn2+onβ-carotene and biomass

2.5 Cu2+对β-胡萝卜素合成的影响

不同Cu2+质量分数对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响结果见图5。从图5可知，当发酵培养基中添加了不同质量分数的Cu2+时，菌体的生物量和色素含量都有所下降，当培养基中Cu2+的含量达到0.3 mg/kg时，尽管菌体的色素含量与空白组基本相当，但其生物量较空白下降了约6.63%，说明在此含量条件下Cu2+对菌体的生长产生了抑制作用。在一定范围内，随着Cu2+含量的增加，菌体的色素含量基本都出现不同程度的下降，总体上来说不同质量分数的Cu2+都会抑制菌体的生长。

图5 不同Cu2+质量分数对β-胡萝卜素含量及生物量的影响Fig.5 Effects of different concentration of Cu2+onβ-carotene and biomass

据研究表明，类胡萝卜素合成与脂肪酶活力有一定关系，提高脂肪酶活力可以促进类胡萝卜素的合成[15]，本实验中β-胡萝卜素的合成受到抑制，这可能是因为菌体中脂肪酶活力虽得到一定提高，但由于三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素涉及到多种酶促反应，合成过程中利用合成酶、还原酶和异构酶等多种酶，因而一种酶活力的提高可能并不促进β-胡萝卜素的合成，Cu2+可能在提高脂肪酶活力的同时抑制了其他酶的活性。菌体生物量的减少说明Cu2+可能对菌体细胞有毒性，抑制了菌体的生长。

2.6 Ca2+对β-胡萝卜素合成的影响

不同Ca2+质量分数对三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的影响见图6。从图6可知，发酵培养基中添加了Ca2+对菌体的生长基本无不利作用，菌体生物量平均提升约6.45%，但Ca2+却对β-胡萝卜素的合成有抑制作用，尽管添加400mg/kgCa2+时β-胡萝卜素含量达到（62.8±1.81）mg/L，但这与未添加Ca2+时相比β-胡萝卜素的含量低了约8.85%，并且随着Ca2+质量分数的添加β-胡萝卜素的含量缓慢下降，这都说明Ca2+对β-胡萝卜素合成有一定的抑制作用。

图6 不同Ca2+质量分数对β-胡萝卜素含量及生物量的影响Fig.6 Effects of different concentration of Ca2+onβ-carotene and biomass

Ca2+可改变细胞膜的通透性，能够调控细胞膜上物质的转运，一定范围内增加Ca2+质量分数提高了线粒体膜的膜电位，更利于ADP转化为ATP，而ATP能够为细胞增值提供能量，进而促经了菌体的生长[16]。Ca2+含量为1×10-3mol/L时对三孢布拉霉菌体中的脂肪酶活力有促进作用，但当含量＞4×10-3mol/L时，反而会表现出抑制作用[15]，因而当Ca2+的质量分数＞200 mg/kg时，菌体中脂肪酶受到抑制，随之类胡萝卜素的含量下降。有研究发现添加一定质量分数的Ca2+添加到根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，能够增加辅酶Q10的合成[17]，本实验培养基中的Ca2+可能促进了辅酶Q10的合成，辅酶Q10的合成需要3-异戊烯基焦磷酸，而3-异戊烯基焦磷酸是合成β-胡萝卜素的前体，3-异戊烯基焦磷酸被用于合成辅酶Q10，进而抑制了菌体中β-胡萝卜素的合成。

3 结论

本研究通过分析得到玉米浆中金属离子的含量，以金属离子含量为基础，通过单因素试验研究了不同质量分数的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+对三孢布拉氏霉菌生物量和β-胡萝卜素含量的影响，研究发现40～100 mg/kg的Zn2+和30～90 mg/kg的Mn2+对β-胡萝卜素的合成有促进作用；不同质量分数的Fe3+、Cu2+和Ca2+基本都对β-胡萝卜素的合成有抑制作用。不同质量分数的Fe3+和Cu2+对菌体的生长有抑制作用，菌体生物量都出现一定程度的下降，而不同质量分数的Zn2+和Ca2+基本对菌体生长没有影响，50 mg/kg的Mn2+能够促进菌体的生长。本研究以三孢布拉霉正负菌为生产菌株，采用单因素实验探究不同金属离子对β-胡萝卜素合成的影响，为利用玉米浆生产β-胡萝卜素提供一定指导。

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Effect of metal ions from corn steep liquor on producingβ-carotene byBlakeslea trispora

XIANG Mengxiong,YAN Xing,WANG Changgao,DU Xin,LIN Jianguo,CAI Jun*
(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),College of Bioengineering,Hubei University of Technology, Wuhan 430068,China)

Corn steep liquor is a by-product of the corn starch production industry,it contains protein,vitamins,amino acids,and so on.Corn steep liquor is widely used in the production of microbial fermentation,but it also contains a variety of metal ions,which probably affect microbial fermentation production process.Using FeCl3,MnSO4,ZnSO4,CuSO4and CaCl2respectively to simulate Fe3+,Mn2+,Zn2+,Cu2+and Ca2+contained in corn steep liquor,the effect of metal ions from corn steep liquor on producingβ-carotene byBlakeslea trisporawas studied by single factor experiment. The results showed thatβ-carotene biosynthesis was stimulated by Zn2+and Mn2+inB.trispora.Different concentrations of Fe3+,Cu2+and Ca2+had the inhibition effect onβ-carotene synthesis.This work could provide certain guidance by using corn steep liquor as raw materials to produceβ-carotene byB.trispora.

corn steep liquor;Blakeslea trispora;β-carotene;metal ions

Q815

A

0254-5071（2014）11-0070-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.016

2014-09-24

湖北省自然科学基金（2009CDA059）

向梦雄（1989-），男，硕士研究生，研究方向为微生物发酵工程。

*通讯作者：蔡俊（1968-），男，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。