筛网对木葡糖醋杆菌变异的控制

王志国，李从发，钟春燕，向东，王锡彬

（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南椰国食品有限公司，海南海口570311）

筛网对木葡糖醋杆菌变异的控制

王志国1，李从发1，钟春燕1，向东1，王锡彬1

（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南椰国食品有限公司，海南海口570311）

以1 000 mL烧杯为容器，木葡糖醋杆菌在静置培养时，培养液体积为100 mL时，没有变异；增至300 mL时，发生变异，纤维素产量下降38.8%，培养液体积增至700 mL时，变异菌数量高达1.3×106CFU/mL，纤维素产量下降76.3%；120 r/min振荡培养更易发生变异，两种方式培养下的变异现象通过筛网使用而得到控制，从而提高了纤维素产量。

木葡糖醋杆菌；变异；筛网

木葡萄醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）产生的纤维素称为细菌纤维素（bacterial cellulose，BC），因其纯度、结晶度、持水力、杨氏模量高及生物相容性好等独特性能，被广泛应用于食品、医药、造纸、音响等领域[1-3]。

利用木葡萄醋杆菌（Ga.xylinus）生产BC的方式主要有静置培养和搅拌培养2种。搅拌培养法容易在工业发酵罐中进行，而且克服了静置培养中的诸如劳动强度大，占空间，生产效率低下等缺点，因此得以广泛研究[4-6]。但搅拌培养法往往不能获得如静置培养中的膜状BC，而呈现球状、星状、絮状，而且搅拌培养中因为剪切力的存在，往往产生负变异菌株，导致BC产量降低，但剪切力如何使其变异的机制尚不清楚[7-8]。

目前国内外控制变异菌的主要方法是筛选适合搅拌培养的菌株，比如Ga.xylinusBPR2001在搅拌培养中很稳定。在研究Ga.xylinus静置[9]及搅拌培养中的变异问题时发现，2种培养方式条件下的变异现象，可以通过安装筛网得以控制，在静置培养中筛网的作用类似于浅层培养，因为Ga.xylinus在浅层培养中很稳定，在搅拌培养中，筛网起到了黏附纤维素的作用，从而减弱了剪切力对菌体的破坏，从而提高了BC产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木葡萄醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）：海南大学食品学院分离保存。

液体培养基：葡萄糖2.0 g、蛋白胨0.5 g、酵母膏0.5 g、柠檬酸0.115 g、磷酸氢二钠0.27 g，加入100 mL水中，pH 5.0，121℃灭菌20 min。

固体培养基：上述液体培养基中加入2.0 g琼脂。

葡萄糖、柠檬酸、磷酸氢二钠均为分析纯：天津大茂化学试剂厂；蛋白胨、酵母膏、琼脂：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器：上海三申医疗器械有限公司；SHP-1500生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；SHZ-82气浴恒温振荡器：常州市华普达教学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液制备及培养

种子液制备：固体培养基上在30℃条件下培养10 d，挑取10个菌落接入100 mL液体培养基中，30℃条件下，静置培养4 d。

培养方法：种子液按体积分数5%接入液体培养基中，30℃条件下静置培养或120 r/min摇床振荡培养4 d。

1.3.2 筛网的制作

静置培养用筛网的制作：用孔径为1 mm的不锈钢筛网作材料，中间打1小孔，使其易插入玻璃棒，玻璃棒下端插入至胶塞中，使筛网便于放置在1 000 mL烧杯中（见图1A），筛网离液面的高度视培养液体积而定，当培养液为300 mL时，则使筛网处于200 mL处，以此类推，调节筛网的高度，使其适合于500 mL及700 mL培养液的使用。

振荡培养用筛网的制作：选取同静置培养一样的材料，根据烧杯的大小裁成长方形，其在烧杯中的高度约高于培养液的液面1 mm（见图1B）。

图1 静置(A)及振荡(B)培养筛网Fig.1 Beakers with stainless steel mesh filter used forGa.xylinus under stationary cultivation(A)and shake cultivation(B)

1.3.3 分析方法

变异菌的计数：培养液经梯度稀释后，涂布于琼脂平板上，根据变异菌落的形态特征计数。

细菌纤维素（BC）的产量测定：收集纤维素，置于80℃、0.1 mol/L NaOH溶液中，维持2 h，冷却后用0.1 mol/L HCl中和，自来水充分洗涤，在80℃条件下干燥至质量恒定[10]，称细菌纤维素质量。

2 结果与分析

2.1 变异菌与正常菌的差异

培养液经过合适稀释，取0.1mL涂布于固体培养基上，30℃条件下培养7 d，结果见图2。

由图2可知，变异菌与正常菌的菌落外观差异显著，正常菌的菌落小而凸起，表面干燥，变异菌的菌落扁平而大，表面湿润。

2.2 培养液体积对Ga.xylnius静置培养中的变异及其BC

产量的影响

以1000mL烧杯为容器，木葡萄醋杆菌在静置培养时，培养液体积分别为100 mL、300 mL及700 mL，在30℃条件下静置培养4 d，对Ga.xylinus静置培养中的变异菌数及其细菌纤维素产量的影响结果见图3。

图2 正常(A)及变异(B)Ga.xylinus菌落的形态Fig.2 Colonial morphology of normal strain(A)and abnormal strain(B)ofGa.xylinus

图3 培养液体积对Ga.xylinus静置培养中变异菌数量及BC产量的影响Fig.3 Effects of media volumes on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylniusunder stationary cultivation

由图3可知，静置培养过程中，变异菌数量与培养液体积负相关。培养液体积为100 mL时，Ga.xylinus未发生变异，培养液体积为300mL时，变异菌数量达到6×105CFU/mL，培养液体积为700 mL时，变异菌数量达到1.3×106CFU/mL，这与先前的实验结论一致[9]。静置培养中，细菌纤维素BC产量与培养液体积负相关。BC产量的差异达到极显著（P＜0.01）。培养液体积为700mL时，BC产量仅为0.19 g/L，其大小只有培养液体积为100 mL时（0.80 g/L）的1/5。

研究表明，Ga.xylinus静置培养时，BC产量与气/液界面的面积正相关，与培养液体积无关，因为在气/液界面有充足的氧气，Ga.xylinus能很好地生长繁殖及产生BC[11-12]。但SURMA-LUSARSKAB等[13]发现培养液体积在50～200mL之间变化时，BC产量与培养液体积负相关。出现这些不一致的结论的可能原因就在于所用的菌株是否在静置培养条件下发生了变异。

不发生变异时，决定BC产量的关键因子为气/液界面面积，而如果有变异菌株，BC产量则随培养液体积增加而减小。本实验中，培养液体积越多，BC产量越少，其原因是因为变异菌数越多。

2.3筛网对Ga.xylnius静置培养中变异现象的抑制

当在静置培养液（300 mL、500 mL、700 mL）中安装筛网后，变异现象消失，且BC产量相差不大，结果见表1。

表1 筛网对Ga.xylinus静置培养的变异菌数及BC产量的影响Table 1 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation

由表1可知，BC产量相差不大的原因在于不同体积的培养液中，气/液界面面积皆为78.5 cm2，而气/液界面为细胞生长繁殖及产BC的最活跃层[14]，因此产量相当。而没有安装筛网，不同体积的培养液中尽管表面积一样，但由于变异菌的出现，变异菌在表面占有生长优势，导致BC产量下降，培养液体积越大，变异菌数量越多，因此BC产量更低。

2.4 筛网对Ga.xylnius振荡培养中变异现象的抑制

表2 筛网对Ga.xylinus静置及振荡培养中变异菌数及BC产量的影响Table 2 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation and shake cultivation

由表2可知，在1 000 mL烧杯中培养液体积500 mL时，在30℃条件下静置及120 r/min振荡培养4 d，Ga.xylnius衰退菌数量分别为1.2×106CFU/mL，3.5×106CFU/mL，二者差异极显著（P＜0.01），说明振荡培养更易使Ga.xylinus变异，这与前人的结论相符[15]；静置培养中BC产量（0.28 g/L）约是振荡培养中（0.03 g/L）的9倍，说明静置培养中BC量比振荡培养中高。

使用筛网后，2种培养方式中的变异都得到了控制（见表2），但BC产量差异仍极显著（P＜0.01）。通常认为振荡培养产BC效率低的原因是变异菌株的出现[7-8]，但从本实验结果看，即使没有变异现象，振荡培养产BC效率仍较低（0.20 g/L），似乎振荡培养BC产量低应有另外的原因。

振荡培养中的剪切力作用，使Ga.xylnius易变异[7-8]，而筛网可以截留携带BC的细胞，使其定居下来，顺利地在筛网上成膜，培养液体积为500 mL振荡培养中，在筛网上产生的膜状BC，消除或者抑制了剪切力对菌株的不良影响，从而抑制变异产生。

3 结论

Ga.xylinus在静置培养时，培养液体积越大，变异越容易发生，从而导致BC产量降低，筛网的安装，可以消除变异现象，此时培养液体积300～700 mL皆可，但所获得的BC量差异不大；振荡培养比静置培养更容易发生变异，筛网安装能消除变异现象，从而提高BC的产量。静置培养中筛网的作用类似于浅层培养，因为Ga.xylinus在浅层培养中很稳定，在搅拌培养中，筛网起到了黏附纤维素的作用，从而减弱了剪切力对菌体的破坏，从而提高了BC产量。

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Inhibition of mesh filter on mutation ofGluconacetobacter xylinus

WANG Zhiguo1,LI Congfa1,ZHONG Chunyan2,XIANG Dong1,WANG Xibin1
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.Hainan Yeguo Foods Co.,Ltd.,Haikou 570311,China)

Using 1 000 ml beaker as container,under stationary cultivation ofGluconacetobacter xylinus,mutation didn’t occur when the loading volume was 100 ml.However,mutation ofGa.xylinusoccurred under stationary cultivation in 300 ml medium,which led to decrease of bacterial cellulose(BC)yield by 38.8%.When the medium volume increased to 700 ml,BC yield decreased 76.3%,and the mutant bacterial number was 1.3×106CFU/ml.Compared with static cultivation,mutation rates ofGa.xylinuswere higher,when shaking at 120 r/min.Mutation was inhibited by mesh filter no matter which cultivation method was used.Thereby the cellulose production was increased.

Gluconacetobacter xylinus;mutation;mesh filter

Q939

A

0254-5071（2014）11-0067-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.015

2012-09-18

海南省重大科技项目（ZDZX2013011）

王志国（1974-），男，副教授，硕士，研究方向为食品微生物。