两个不同发酵时期豆瓣中微生物多样性的差异对比

董丹，关统伟，赵辉平，车振明，张怡，郑萍，张静

（西华大学微生物研究所食品生物技术四川省高校重点实验室，四川成都610039）

两个不同发酵时期豆瓣中微生物多样性的差异对比

董丹，关统伟*，赵辉平，车振明，张怡，郑萍，张静

（西华大学微生物研究所食品生物技术四川省高校重点实验室，四川成都610039）

为了探明传统自然发酵豆瓣不同时期微生物的多样性的差异对豆瓣风味品质的影响，采用纯培养的分离方法，对发酵中期（5个月）时期和成熟期（10个月）豆瓣进行了细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的基因分析。结果表明，这两个时期豆瓣中的微生物种类丰富，且差异很大。从发酵五个月的豆瓣中分离得到7个属（Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Candida、Wickerhamomyces），优势菌为Bacillus、Candida、Wickerhamomyces属，分别占54%、11%、14%。成熟期中分离得到8个属（Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus属），优势菌为Bacillus、Oceanobacillus、Halomona属，分别占55%、16%、10%。

发酵豆瓣；微生物多样性；系统发育分析

豆瓣是我国传统特色发酵食品的典型代表，历史悠久，为中华传统生物食品产业之瑰宝。目前，豆瓣从传统的烹饪调料发展到系列复合调味品销售遍布全国，并出口美国、加拿大、新西兰、日本等国家。

豆瓣是以优质的蚕豆和辣椒为主要原料，经自然发酵而成的半流动黏稠体或半固态调味品。豆瓣自然发酵过程一般包括发酵制曲阶段、发酵初期、发酵期3个阶段，每个时期参与作用的微生物都存在一定的差异。在制曲阶段，霉菌能够分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多种酶，其中蛋白酶和肽酶将原料中蛋白质分解成多肽及多种氨基酸；淀粉酶系把淀粉转化成葡萄糖、双糖、三糖等；这些氨基酸和糖类不仅是豆瓣风味的来源，而且为后阶段其他微生物的生长创造条件。在发酵初期，酵母将糖发酵成酒精和二氧化碳，酒精既参与酯类的合成，又能被氧化成有机酸类，在豆瓣风味形成过程中发挥重要作用。自然发酵豆瓣酱醅中也存在一些对豆瓣品质有不良影响的真菌，如毛霉和青霉能产生霉臭味，影响豆酱的风味；产毒黄曲霉和寄生曲霉还可产生黄曲霉毒素（Aflatoxins，AF）B1，其具有强烈的致癌、致畸和致突变作用，是食品安全重大隐患[1-5]。此外，细菌在豆瓣自然发酵中也发挥着重要的作用，在豆瓣发酵过程中乳酸菌产生的有机酸与酵母产生的酒精形成酯类物质，增添豆瓣的风味，同时还能抑制一些杂菌的生长[6]。学者们采用非培养和纯培养技术探测了豆瓣中的微生物种群，但关于豆瓣发酵期间不同时期的微生物动态变化研究较少[7-10]。不同发酵周期豆瓣微生物发酵体系存在差异，种群组成特点，微生物种群类别，在不同自然发酵周期中的变化，种群的变化对发酵豆瓣的质量和风味的影响等问题还没有被完全阐述清晰。因此，针对不同发酵时期微生物的动态变化研究将对我国传统宝贵技术资源的理解和规模化生产豆瓣工艺的提高以及风味多样性的改善提供科学依据，这对于人工控制不同时期豆瓣发酵技术也将具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆瓣样品：四川郫县娟城豆瓣有限公司；Goldview、Tris碱、EDTA：上海生工生物工程有限公司；甘油、无水乙醇，异戊醇：都市科龙剂化工厂；Extaq DNA聚合酶、dNTP：大连Takara公司。

主要分离细菌培养基：高氏1号培养基（可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4）；LB培养基（蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2）；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[12]。

主要分离真菌培养基：孟加拉红培养基[11]、麦芽汁琼脂（麦芽汁抽提物20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.7）、查氏培养基（蔗糖30 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.5 g，K2HPO41.0 g，NaNO33.0 g，水1 000 mL，pH 6.7）、萨氏培养基（蛋白胨10 g，琼脂20 g，麦芽糖40 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8）。

1.2 仪器与设备

S1000TM Thermal Cycle PCR仪：美国Bio-Rad公司；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F双人双面净化工作台：苏州净化有限公司；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱、DHP-9052电热恒温培养箱：上海益恒实验仪器有限公司；PHS-3C酸度计：方舟科技有限公司；TB-214电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣微生物分离

由于目前对豆瓣发酵过程中微生物组成的研究主要集中在制曲阶段和发酵初期，因此本实验选用发酵中期（5个月）与成熟期（10个月）的样品作为研究对象，以弥补对发酵中后期研究的缺陷。

采用平板稀释分离法筛选豆瓣中的细菌。称取辣椒胚与甜瓣子的混合豆瓣样品10 g，放入装有90 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠，120 r/min振荡过夜，使样品与水充分混合，得到10-1豆瓣悬浮液。依次制作10-2、10-3、10-4悬浮液。吸取0.1 mL 10-1、10-2、10-3、10-4豆瓣悬浮液分别涂布于分离培养基上，每个浓度设置三个重复并编号。分别在30℃、37℃倒置培养1～7 d后观察菌落形态，进行菌落统计[13]。

1.3.2 微生物的纯化

121℃高压灭菌30 min，用无菌竹签挑取分离培养基上的细菌单菌落，采用划线法在纯化培养基上进行纯化培养。

1.3.3 豆瓣样品中总DNA的提取

用无菌竹签挑取绿豆大小，纯化后的菌体于1.5 mL的离心管中，DNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）[14-15]法。得到的样品总DNA于-20℃保存，作为后续PCR的模板。

1.3.4 PCR及产物的纯化

以提取得到的DNA为模板，细菌选择通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应条件：95℃、4 min；95℃、60 s，56℃、60 s，72℃、120 s，35个循环；72℃、10 min。真菌选择引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反应条件：预变性95℃、4 min；循环94℃、30 s，退火53℃、30 s，延伸72℃、40 s，35个循环；延伸72℃、7 min。PCR反应体系为50 μL：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间40 min。

纯化过程按照DNA胶回收试剂盒中的步骤进行，具体步骤参照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit试剂盒说明。

1.3.5 测序

PCR产物纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST（basic local alignment search tool）序列分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时期豆瓣样品中微生物多样性

2.1.1 发酵中期（5个月）的豆瓣微生物多样性

从发酵中期豆瓣样品中总共分离得到148株菌。通过形态学特征及生理实验选出14株典型菌株，其测序比对结果如表1。

14株菌经序列比对分属于微生物的7个属，即Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Candida、Wickerhamomyces。148株菌中芽孢杆菌属（Bacillus）有80株，占到总分离菌株的54%；Candida属和Wickerhamomyces属分别有17株和21株，占鉴定菌株的11%和14%，因此这3个属可能是发酵5个月豆瓣样品中的主要优势菌；另外4个属（Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia）相应微生物数量所占比例分别为7%、5%、5%、4%。

2.1.2 成熟期（10个月）豆瓣微生物多样性

从成熟期豆瓣样品中总共分离得到145株菌，通过形态学特征及生理实验选出20株典型菌株，其测序比对结果如表2。

表1 发酵中期(5个月)样品中微生物多样性分析Table 1 Analysis of microbial diversity in the sample fermented for five months

表2 成熟期(10个月)样品中微生物多样性分析Table 2 Analysis of microbial diversity in the sample matured for ten months

20株菌经序列比对分属于微生物的8个属，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus。145株菌中芽孢杆菌属（Bacillus）80株，海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）23株，嗜盐单孢菌（Halomonas）14株，分别占总鉴定菌株的55%、16%、10%。这3个属可能是成熟期豆瓣样品中的主要优势菌；另外5个属（Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus）相应微生物数量所占比例分别为5%、5%、4%、4%、1%。

从表1和表2的结果可以看出，Bacillus属作为绝对的优势菌存在于发酵中期和后期，这与芽孢杆菌具有极强的耐受性有直接的关系。芽孢杆菌具有一定的抑菌和发酵作用，同时能产生多种消化酶，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，可有效将豆瓣中的淀粉、蛋白质、脂肪分解为糖、氨基酸和醇类。在豆瓣发酵的数个月中，芽孢杆菌产生的各种酶类对豆瓣风味物质的形成起着至关重要的作用。Candida和Wickerhamomyces两种酵母出现在发酵5个月的豆瓣样品中，作为发酵中期和后期的优势菌之一，酵母产生的酒精和乳酸产生的有机酸形成酯类物质，增添豆瓣的风味，同时还能抑制一些杂菌的生长[16]。酱醅中糖含量高，pH适宜，酵母的酒精发酵旺盛，酱醅的酒精含量可超过2.0%，同时生成少量甘油、琥珀酸以及其他多元醇[17]，对于豆瓣风味物质的形成十分重要。到发酵后期豆瓣中的理化性质发生了变化，酵母的耐受性降低，不再作为优势菌存在，而海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）和嗜盐单孢菌（Halomonas）成为除芽孢杆菌（Bacillus）外的优势菌，可能对豆瓣后期发酵起着重要作用。

2.2 不同发酵时期细菌和真菌组成差异分析

2.2.1 不同时期细菌的组成差异分析

选取两个不同发酵时期典型细菌菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA4.0软件构建系统发育树，所用方法为邻接法，结果见图1。

图1 细菌16s rRNA系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA sequence

由图1中2个时期豆瓣微生物系统发育分析可以看出，豆瓣发酵从发酵中期到成熟期（10个月）的过程中细菌的组成存在一定的差异。豆瓣样品中总共分离得到的细菌有7个属，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Enterobacter。在豆瓣发酵中期的样品中分离得到有5个属，即Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Enterobacter属，结合表1和表2可以得到，通过BLAST检索发现这5个属与其具有最高同源性菌株的相似性分别为99%、99%、98%、99%、100%。而成熟期新增Halomonas属和Gracilibacillus属，它们与具有最高同源性菌株的相似性都是99%。Bacillus、Oceanobacillus、Lactobacillus、Virgibacillus一直存在与发酵中期和发酵后期，可能为豆瓣发酵期的重要功能菌。

2.2.2 不同时期真菌的组成差异分析

选取两个发酵时期分离得到的真菌序列，使用MEGA4.0软件构建系统发育树，结果见图2。

图2 真菌18S rRNA系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of fungal 18S rRNA sequence

从图2可以看出，从两种豆瓣样品中总共分离得到4个属的真菌，即Pichia、Candida、Wickerhamomyces、Aspergillus，结合表1和表2可以得到，其与具有最高同源性菌株的相似性分别为99%、100%、99%、98%。Candida、Wickerhamomyces两种酵母出现在发酵中期，在发酵后期没有出现，说明在豆瓣发酵的中期豆瓣风物物质的形成可能与这两种酵母的发酵有着直接的关系，而到豆瓣发酵后期由于酵母耐受性降低，不再作为主要优势菌存在。此外，在成熟期仍然检测到有曲霉（Aspergillus）的存在，这种曲霉很可能为添加发酵曲中遗留的菌株。

3 结论

本研究通过纯培养的分离方法结合细菌16S rRNA和真菌的18S rRNA的基因分析对豆瓣发酵中期及后期的微生物组成进行了研究，分析了两个时期微生物的组成差异，研究表明，豆瓣发酵过程中微生物的组成发生了一定程度的变化，细菌存在于整个发酵中期及后期，并处于优势地位，酵母多作为优势菌存在于发酵中期，发酵后期以细菌为主要优势菌。根据本实验研究，豆瓣发酵中期与后期微生物群落发生了很大的变化且微生物的种类相当丰富，其中在发酵中期及后期以芽孢杆菌为主要的优势菌。除此之外，从实验结果来看，嗜盐单胞菌的比例也很高，这也可能是嗜盐单胞菌能形成孢子潜伏在豆瓣发酵过程中，对于其存在是否对豆瓣发酵有一定影响还需要做进一步的研究。Candida和Wickerhamomyces两种酵母是发酵中期主要的优势菌群。

[1]徐坤，王涛.响应面法优化混合发酵法控制郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1含量的最佳制曲条件研究[J].中国酿造，2009，28（11）：28-31.

[2]靳学敏，车振明.浅谈豆瓣生产过程中的安全控制[J].中国食品工业，2010，21（1）：62-63.

[3]高雅，丁文，张琦，等.传统发酵豆瓣中产毒黄曲霉高效拮抗菌的筛选[J].微生物学通报，2010，37（3）：369-374.

[4]TENIOA O D,ADDO P A,BOOST I M,et al.Degradation of aflatoxin B1 by cell-free extracts ofRhodococcus erythropolisandMycobacterium fluoranthenivoranssp.nov.DSM44556T[J].Int J Food Microbiol,2005, 105(1):111-117.

[5]CHO K M,MATH R K,HONG S Y,et al.Iturin produced byBacillus pumilusHY1 from Korean soybean sauce inhibits growth of aflatoxin producing fungi[J].Food Control,2009,20(4):402-406.

[6]刘超兰，黄著，彭熙敏，等.乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究[J].中国酿造，2009，28（1）：105-108.

[7]张琦，汪先丁，杨虎，等.郫县豆瓣自然发酵过程中细菌群落结构的变化[J].食品与发酵科技，2010，46（6）：16-18.

[8]孙雯，葛箐萍，叶广彬，等.传统豆酱发酵过程中霉菌的形态学分析[J].中国农学通报，2014，30（15）：298-304.

[9]葛菁萍，柴洋洋，陈摇丽，等.传统豆酱发酵过程中细菌多样性动态[J].生态学报，2012，32（8）：2532-2538.

[10]马世玲.郫县豆瓣产品特点、工艺特征、纯种分离及生产应用[J].食品与发酵科技，2009，45（1）：20-22.

[11]孙丽，朱军，李晓瑾，等.新疆阿魏内生真菌菌群多样性[J].微生物学报，2014，54（8）：936-942.

[12]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[13]LUCA C,PAOLA D,KALLIOPI R.Biodiversity and dynamics of meatfermentations:The contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem[J].Meat Science,2011,89(1):296-302.

[14]CHEN Q,WEI S,DENG Z,et al.Optimization of DNA extraction from seeds ofSorghum sudanense(Piper)Stapf[J].Not Bot Hort Agrobot Cluj,2009,37(1):256-260.

[15]MISHRA M K,RAN N S,RAM A S,et al.A simple method of DNA extractionfromcoffeeseedssuitableforPCRanalysis[J].Afr J Biotechnol,2008,7(4):409-413.

[16]汪先丁，刘敏，高鹏，等.郫县豆瓣自然发酵过程中真菌菌落的演替及黄曲霉毒素B1的消长[J].食品科学，2012，11（5）：142-145.

[17]李治华，王自鹏，胡静，等.传统与商品郫县豆瓣酱挥发性成分的比较分析[J].现代食品科技，2014，30（4）：268-273.

Differences in microbial diversity at two different fermentation stages of soybean paste

DONG Dan,GUAN Tongwei*,ZHAO Huiping,CHE Zhenming,ZHANG Yi,ZHENG Ping,ZHANG Jing
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihua University,Chengdu 610039,China)

In order to explore the effect of microbial diversity at the different fermentation stages on the soybean paste quality,the bacterial 16S rRNA and fungal 18S rRNA from the soybean paste samples fermented for five months and matured for 10 months were conducted by culture media method.The results showed that the both samples were rich in microbial diversity and had the difference.Isolates from the sample fermented for five months belonged to seven genus(Bacillus,Oceanobacillus,Virgibacillus,Lactobacillus,Pichia,Candida,Wickerhamomyces).The dominant microbes were Bacillus,Candida and Wickerhamomyces,and they accounted for 54%,11%and 14%,respectively.The isolates from the mature samples belonged to eight genus(Bacillus,Halomonas,Oceanobacillus,Virgibacillus,Lactobacillus,Gracilibacillus,Pichia,Aspergillus).The dominant microbes wereBacillus,OceanobacillusandHalomona,and they accounted for 55%,16%and 10%,respectively.

fermented soybean paste;microbial diversity;phylogenetic analysis

Q93-331

A

0254-5071（2014）11-0055-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.012

2014-10-08

教育部春晖计划项目（No.13205639）；食品生物技术四川省高校重点实验室项目（No.Szjj2013-045）；四川省教育厅基金项目（No.13205688）

董丹（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品加工。

*通讯作者：关统伟（1978-），男，副教授，博士，研究方向为微生物系统学与功能基因组学、食品微生物发酵工程。