武陵山区桑葚酿酒酵母菌种筛选研究

王杰利，潘丽梅，王殿东，戴玄*（长江师范学院，重庆408100）

武陵山区桑葚酿酒酵母菌种筛选研究

王杰利，潘丽梅，王殿东，戴玄*
（长江师范学院，重庆408100）

采用成熟的武陵山桑葚为原料，对其自然发酵液中的酵母菌进行筛选鉴定，经过初筛、复筛，得到4株起酵快、有明显酒香的优良的酵母菌。通过形态观察与生理生化试验鉴定，分别是红酵母属（Rhodotorula）中的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）中的酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae）、假丝酵母属（Candida）中的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。并对这4种酵母菌进行了生长特性、残糖量、乙醇产量进行研究，为将来利用所筛选的酵母菌取代普通市售的葡萄酒酵母在桑葚酿酒工艺中的应用研究奠定了理论基础。

武陵山；桑葚酵母；筛选；鉴定

桑葚酒是桑葚深加工产品的一种，根据其生产工艺的不同，桑葚酒大体上可以分为发酵酒和配制酒两种。目前，在我国研究和生产中发展较快的是发酵酒[1]。发酵型桑葚酒是以成熟桑葚为原料，经酒精发酵而成的果酒。在桑葚酒的研制过程中，对发酵菌种、发酵工艺和复合果酒[2]等的研究很多，为桑葚酒的进一步开发奠定了基础[3-4]。但是，研究还局限在实验室阶段，真正转入工业化生产尚需进一步研究。桑葚发酵果酒的酿造品质在很大程度上和所用酵母的特性有关，不同酵母菌株的发酵速率、产酒精能力和对发酵环境的适应性不同，所得酒的质量和风味也不同。本研究采用形态观察及生理生化实验方法对桑椹酒发酵过程中的酵母菌株进行筛选与鉴定。以发现适合桑葚酒发酵的优良菌株。目前，国内外利用桑葚发酵生产果酒的研究报道不多，关于武陵山区桑葚酿酒酵母筛选研究资料未见报道，武陵山区桑葚资源丰富，具有广阔的市场开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

桑葚（Morus alba）：采自涪陵区李渡桑葚实验基地（武陵山区）；酵母（Saccharomyces）：筛选自桑葚自然发酵的发酵液。

1.1.2 培养基

桑葚原汁培养基：采自长江师范学院实验基地（武陵山区）的成熟桑葚经过粉碎、匀浆、巴氏杀菌所得。

虎红（富集）培养基：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁0.5 g/L、琼脂20.0 g/L、孟加拉红0.033 g/L、氯霉素0.1 g/L。

麦芽汁培养基（海博生物技术有限公司）：麦芽浸粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH值5.6±0.2。

土豆葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar，PDA）：马铃薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂20.0g/L、pH值5.4～5.8。

玉米粉琼脂培养基（海博生物技术有限公司）：玉米浸粉7.0 g/L、琼脂15.0 g/L、pH值6.0±0.2。

同化基础培养基：参照酵母菌的特征与鉴定手册配方配制。

碳源基础培养基：同化培养基中除不含氮源外，含有L-组氨酸1 mg、DL-蛋氨酸2 mg、DL-色氨酸2 mg，定容至1 L。

氮源基础培养基：同化培养基中除不含碳源外，含有5 g硫酸铵，但不含L-天冬氨酸，定容至1 L。

Gorodkowa琼脂培养基（产子囊孢子培养基）：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L。

醋酸盐琼脂培养基：醋酸钾9.8 g/L，D-葡萄糖1 g/L，NaCl 1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，酵母粉2.5 g/L，琼脂20 g/L。

尿酶实验用培养基（尿素分解培养基）：尿素20 g/L，酵母粉0.1 g/L，KH2PO41 g/L，NaH2PO40.1 g/L，酚红0.01 g/L。所有培养基均在121℃高压灭菌15 min。

1.1.3 主要试剂

重氮基蓝（diazo base blue，DBB）试剂[5]：上海劲马实验设备有限公司；取0.1 g重氮基蓝B盐溶解在冷的0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中。pH 7.0、4℃条件下保存。

饱和孔雀绿染液：取孔雀绿7.6 g溶于100 mL蒸馏水中，充分溶解配成7.6%的饱和孔雀绿溶液。

0.25 %沙黄染液：取沙黄0.25 g，置于乳钵内，加入体积分数为95%的乙醇10 mL，充分研匀，溶解，取出后定容至100 mL。

其他化学试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

722S紫外分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海棱标仪器有限公司；PQX-1000A人工气候箱：上海博迅实业有限公司；THZ-82摇床：常州冠军仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离与筛选

（1）菌种采样

将刚采摘的桑葚立即运回实验室用无菌水简单水洗后，破碎。取灭菌后的250 mL锥形瓶10个，分别装入100 g破碎的桑葚，密封发酵，待液体逐渐增多，发酵逐渐增强，直至发酵中期产气非常剧烈，酵母菌浓度非常大时取样[6]。

（2）富集培养与纯种分离

将配制的虎红培养基分装于100 mL三角瓶内，每瓶30 mL，高压蒸汽灭菌冷却，然后分别取发酵液3 mL各3份接种，于120 r/min、28℃条件下摇床培养18～36 h[7]。

（3）菌种初筛

实验通过对酵母菌的大菌落观察，挑选具有典型酵母菌形态的菌落，并进一步进行产气实验对所筛选的菌种进行初步筛选[8]。

（4）菌种复筛

分别以糖度、pH值、SO2添加量及乙醇体积分数作为菌种生长及发酵的影响因素，测定该菌种的耐性[9-10]。1.3.2菌种鉴定[11-12]

（1）形态学观察

观察液体及固体平板上的菌落形态，在显微镜下观察玉米粉琼脂培养基及Gorodkowa琼脂培养基上假菌丝及子囊孢子的形态。

（2）生理生化实验

采用尿素酶实验、重氮基蓝B（DBB）实验、糖类发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验等生理生化实验来鉴别筛选菌种。

1.3.3 菌种特性研究

（1）生长曲线的测定

取盛有180 mL桑葚培养液的500 mL锥形瓶5个，各瓶中加入已活化10h的酵母培养液20mL，在28℃恒温培养[13]，于培养后的0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h，分别用无菌移液管从各瓶中吸取培养液3 mL，以1 cm比色皿比浊，以未接种的桑葚培养液为参比，在波长660 nm处分别测定其光密度（OD660nm值）。并以培养时间t为横坐标，OD660nm值为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）发酵过程理化指标的变化[14-16]

将桑葚破碎，把糖分调整至200 g/L，取100 mL桑葚汁于250 mL的三角瓶中，在28℃、120 r/min条件下振荡培养12 h后，静置发酵，每隔6 h摇晃一次，并放气（排掉发酵过程中产生的CO2，避免瓶内压强过大发生意外）。每隔24h，用糖度计测量一次残糖（主要为蔗糖的浓度），并用酒精计测量一下酒精度变化。

2 结果与分析

2.1 菌种分离与筛选

2.1.1 菌种分离

经富集培养和划线分离纯化，共分离出酵母菌43株。

2.1.2 菌种初筛

从采集的样品中共分离到43株酵母菌。通过菌落观察，挑出具有典型酵母菌菌落特征的菌株28株。初筛入选菌经杜氏小管产气实验得到10株具有较强发酵力的菌株，且发酵液带有明显酒香，并依次编号1#、2#、……9#、10#。其中有2株酒香浓郁的菌株在12 h内将杜氏管充满气体，5株菌种在24 h内将杜氏管充满气体，结果见表1。

由表1可知，在12 h时5#、9#就已充满气体，说明其发酵力很强，6#、7#、10#在24 h时充满气体，说明发酵力也比较强，可以满足桑椹酒酿造的需要。

表1 优良酵母菌株产气情况Table 1 Carbon dioxide production of yeast strains

2.1.3 菌种复筛

（1）耐高糖性

制备蔗糖质量分数分别为20%、30%、40%、50%、60%的麦芽汁培养基100 mL于250 mL的三角瓶中，灭菌后分别接种产气在36 h内完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3组平行实验，28℃培养72 h，以麦芽汁培养基作对照，在紫外光波长660 nm处测其吸光度值（OD660nm值）并记录，结果见图1。

图1 菌种耐高糖性实验Fig.1 High sugar concentration tolerance of strains

由图1可知，5#、7#、9#、10#菌株在蔗糖质量分数为50%时依然具有很强的生长活性，5#、7#受蔗糖浓度影响最轻，9#在蔗糖质量分数为30%～50%内所受影响几乎相同。因此在发酵初期高糖质量分数的条件下，这些菌株可以迅速繁殖，缩短发酵周期。

（2）耐酸性

制备pH2.0、3.0、3.8、4.5的麦芽汁培养基100mL于250 mL的三角瓶中，灭菌后分别接入产气在36 h内完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3组平行实验，28℃培养72 h，以麦芽汁培养基作对照，在紫外光波长660 nm处测其吸光度值（OD660nm值）并记录，结果见图2。

图2 菌株耐酸性实验Fig.2 Acidity tolerance of strains

由图2可知，5#、10#、9#菌株都有较好的耐酸能力，在pH值为3.0的条件下依然具有较强的生长活性。桑葚酒初发酵时果汁的pH值一般为3.6左右，因此在发酵初期低pH值的环境下可以迅速繁殖，缩短发酵周期。

（3）耐SO2能力

从耐高糖性和耐酸性实验中挑取3株表现突出的菌株（分别是5#、9#、10#），做耐SO2浓度实验（另外加入4#，因其菌落为红色，想了解一下其在果酒发酵中的作用）。按亚硫酸含SO2量为6%计，计算出质量浓度60 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L所需的量，分别加入麦芽汁中制成不同质量浓度SO2的系列培养基。加入杜氏小管倒置使其充满麦芽汁，塞好棉塞，121℃、15min灭菌。灭菌后，待试管温度降至常温后加入亚硫酸，加完后摇匀。最后在试管中接入对数期酵母1 mL（约1×107个），28℃静置培养，并观察产气情况，结果见表2。

表2 菌株耐SO2浓度实验Table 2 Sulfur dioxide concentration tolerance of strains

由表2可知，在SO2质量浓度达到120 mg/L时，只有5#菌株在24 h时充满气体，保持很强的生长活性。当SO2质量浓度达到240 mg/L时，5#、9#菌株在48 h充满气体，依然具有较强的生长活性，说明5#、9#菌株具有很强的耐SO2能力，因此在发酵初期高SO2质量浓度条件下可以迅速繁殖，从而缩短发酵周期。

（4）耐酒精度

从耐高糖性、耐酸性和耐SO2实验中挑取3株表现突出的菌株（分别是5#、9#、10#），做耐酒精度实验（另外加入4#，因其菌落为红色，想了解一下其在果酒发酵中的作用）。通过计算麦芽汁与无水乙醇的比例分别配制含乙醇体积分数0、10%、12%、14%、16%、18%、20%的培养基，每管先加入麦芽汁，然后加入充满麦芽汁的杜氏小管，并使其倒置，塞好棉塞，121℃、15 min灭菌。灭菌完后，待试管温度至常温后加入酒精，摇匀，最后在试管中接入对数期酵母1 mL（约1×107个），28℃静置培养，并观察产气情况，结果见表3。

表3 耐酒精度实验Table 3 Alcohol tolerance of strains

由表3可知，当酒精度达到14%vol时，5#、9#菌株具有很强的生长活性；当酒精度达到16%vol时，5#菌株依然具有较强的生长活性并在24 h时就充了2/3的气体。因此在发酵过程中这些菌株可以很好的耐受次级代谢产物乙醇对其的影响，从而提高产酒率。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 菌种的形态与培养特征

通过菌落观察，显微镜观察以及液体培养等获得了所选菌种的一些特性。由表4可知，通过菌落观察，4#、5#、9#、10#菌株的特异性初步显现，但有待于参照酵母菌的特征与鉴定手册进行进一步比较观察。

表4 菌株的形态与培养特征Table 4 Morphology and cultural characteristics of strains

2.2.2 鉴定实验

（1）发酵实验

发酵实验是采用生理生化实验方法鉴定酵母菌必做的系列实验，它主要是了解菌种的发酵特性，能利用哪些糖类来发酵，结果分别见表5和表6。

表5 菌株特征性实验结果Table 5 Result of strains characteristic experiment

由表5可知，5#、9#、10#菌株具有很好的发酵性能，其中9#、10#在一定条件下可以产生子囊孢子。

表6 糖发酵特性实验结果Table 6 Result of sugar fermentation characteristics experiment

由表6可知，5#、9#、10#菌株都能利用葡萄糖进行发酵，其中5#、9#菌株还能利用麦芽糖、蔗糖、半乳糖等进行发酵。2.2.3同化实验

同化实验包括碳源同化实验和氮源同化实验，其是生理生化法鉴定酵母菌的核心部分，主要是了解酵母菌种能利用哪些碳源和氮源来生活，从而根据检索表确定其所属的种。

由表7可知，4#、5#、9#、10#菌株同化结果差异很大，可以基本确定它们为不同菌株，其中5#、9#菌株可以利用更多的碳源与氮源，具有更强的适应性。

结合以上实验结果，参照酵母菌的特征与鉴定手册中的检索表可以确定4#菌株为红酵母属（Rhodotorula）中的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株为假丝酵母属（Candida）中的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株为酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccha-romyces cerevisiae）、10#菌株为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）中的酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae）。

表7 同化实验结果Table 7 Results of assimilation experiment

2.3 菌种发酵特性研究

2.3.1 生长曲线

图3 菌种的生长曲线Fig.3 Growth curve of strains

由图3可知，所选的4个菌株生长期比较明显，接近理论上的对数生长。4#、5#、10#起酵都比较快，在3 h时就进入对数增长期，这对发酵非常有利，可以缩短发酵周期。

2.3.2 残糖量

酵母菌的主要作用就是利用糖类来发酵，以获得发酵产物。所以一个优良的菌株其发酵能力一定要强，即对糖类的利用率要高。4#、5#、9#、10#菌株发酵后残糖量如图4所示。

图4 发酵时间对残糖量的影响Fig.4 Effect of fermentation time on residue sugar

由图4可知，5#菌株残糖量最低，对糖类的利用最彻底，9#菌株其次。5#、9#、10#菌株在第5天时均达到较低的残糖水平，发酵进入停滞阶段，其中5#菌株残糖量最低达到15 g/L左右。

2.3.3 酒精度

筛选桑葚酒酿酒酵母的一个主要指标就是酵母菌株的产酒精的能力。4#、5#、9#、10#菌株发酵后酒精度如图5所示。

图5 发酵时间对酒精度的影响Fig.5 Effect of fermentation time on alcohol content

由图5可知，5#菌株和9#菌株的产酒精能力最高，在第7天均可达到最高产酒精量，且均可达到12%vol左右。10#菌株在第6天也可达到11%vol左右，说明它们都比较适合桑葚酒的发酵。

3 结论

根据同化实验、发酵实验、特征性实验以及形态观察的结果，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》中的检索表，初步确定4#菌株为红酵母属（Rhodotorula）中的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株为假丝酵母属（Candida）中的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株为酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、10#菌株为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）中的酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae）。

实验所筛选的4株酵母菌，具有很强的发酵能力和很强的耐酸、耐高糖性能以及很强的耐高酒精浓度的性能，非常适合桑葚酒的发酵。研究结果为武陵山区桑葚酒的酿造工艺及开发工作提供了理论依据，今后还将对自选酵母与市售葡萄酒酵母在桑葚酒的理化指标、感官指标、营养风味等方面进一步开展研究工作。

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Screening of mulberries wine yeast in Wuling mountain area

WANG Jieli,PAN Limei,WANG Diandong,DAI Xuan* (Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

Mature mulberry in Wuling mountain was used as raw material,and the yeast in natural fermented liquid was screened and identified.After preliminary screening and secondary screen,four strains of yeast with fast fermentation characteristic and obvious bouquet were acquired.Through morphology observation and physiological and biochemical identification,the four strains were identified asRhodotorula mucilaginosa, Hanseniaspora vineae,Candida parapsilosisandSaccharomyces cerevisiae.The growth characteristics,residual sugar amount and ethanol production of the four kinds of yeast were studied,in order to lay a theoretical foundation for the application of screened yeast to replace the ordinary commercial wine yeast in mulberry wine making.

Wuling mountain;mulberry yeast;screening;identification

TS262.91

A

0254-5071（2014）07-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.016

2014-05-29

武陵山区研究中心开放基金（WLYF2012002）

王杰利（1990-），男，硕士研究生，研究方向为微生物鉴定。

*通讯作者：戴玄（1963-），男，副教授，硕士，研究方向为应用微生物学。