酿酒酵母有氧发酵培养基的研究

赵小丽，甄玉国*，王兰惠，易晓菲

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

酿酒酵母有氧发酵培养基的研究

赵小丽1，2，甄玉国1，2*，王兰惠1，易晓菲1

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

以实验室选育的酵母菌为试验用菌株，以甜菜糖蜜为碳源发酵生产酵母菌体，通过单因素和正交试验优化实验室摇瓶发酵的培养基，优化后的培养基为总糖含量为10%的糖蜜、10%红糖、0.50%尿素、0.50%酵母粉、0.05%硫酸镁、0.05%甘氨酸，在此培养条件下，菌体干质量可达到16.83 g/L。

甜菜糖蜜；酵母菌；培养基

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为人类利用最早的微生物，其营养成分十分丰富，含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素及生理活性物质等[1]。酵母细胞蛋白构成比较理想，氨基酸种类丰富，尤其是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸[2-3]，由于其具有安全、生长繁殖快、代谢周期短、生产不受季节和气候、土壤、自然灾害的影响，可以在工厂里进行，与传统的农业生产方式相比，过程易于控制，容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点，一直是基础和应用研究的主要对象，并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[4-6]。

糖蜜是制糖工业的副产品，是一种黏稠、黑褐色、呈半流动的物体，糖蜜含有大量的糖、蛋白质和多种矿物质、维生素、纤维素、胺类等，是微生物进行发酵的理想复合原料[7]。因此，利用糖蜜来生产饲料酵母不仅能提高糖蜜的附加值，而且可以充分利用废弃物，有效地保护环境，降低饲料生产企业的成本。饲料酵母所含的营养物质极为丰富，酵母含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、B族维生素、矿物质元素等成分，是饲料蛋白质的有效补充物，作为蛋白质饲料添加到配合饲料中，具有和鱼粉相同的功效[8]。

本试验通过单因素和正交试验设计，研究以甜菜糖蜜为碳源发酵生产高生物量酵母的培养基的最优组合，为工业化生产饲料酵母提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

实验室前期试验获得，经分子生物学鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

1.1.2 材料

甜菜糖蜜：黑龙江拜泉糖厂；红糖（食品级）：市售。

1.1.3 试剂

尿素、甘氨酸、硫酸镁：北京化工厂；葡萄糖、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司。

酵母斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂15 g/L，121℃、0.1 MPa灭菌20 min。

酵母液体种子培养基—酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃、0.1 MPa灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

pHS-2C型数字式酸度计：上海SANXIN公司；AL104电子天平：梅特勒-托利多公司；岛津UV-1201分光光度计：日本岛津公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；YP1200型电子天平：上海精科实业有限公司。HYG-型培养摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司；SPX-150型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-IF型洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及扩大培养

无菌条件下接一环保藏菌种至YPD斜面培养基，30℃培养48h复苏菌种。取一环活化后的斜面菌种转接到装液量为20 mL/100 mL的种子培养基中30℃、180 r/min培养24 h。1.3.2生长曲线的绘制

将斜面保存的优势菌株挑取一环接种于500 mLYPD培养基中，装液量20mL/100mL，在水浴摇床中30℃、180r/min培养，每隔2 h在无菌操作条件下取样，在波长560 nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.3.3 菌体密度测定

菌液经适当稀释后用紫外可见分光光度计在波长560 nm处测定吸光度值。

1.3.4 菌体生物量测定

发酵液5 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤2次后收集菌体，105℃烘干至质量恒定，称量并记录数据。

1.3.5 单因素试验

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，培养基选取糖蜜浓度、氮源、无机盐、生长因子等，研究其对菌株生物量的影响。

1.3.6 培养基条件优化正交试验

根据单因素试验结果，选取对菌体生物量影响较大的因素设计正交试验，研究发酵条件的最佳优化组合。

1.3.7 试验数据

采用SPSS17.0软件，Duncan’s进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 种子液生长曲线的绘制

图1 酿酒酵母生长曲线Fig.1 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiae

测定酵母的生长曲线不但可以清楚的了解酵母的对数生长期、衰亡期以及它的一些生长特性，还可以得出酵母繁殖到最大量的时间以及在随后的生长过程中酵母细胞是否会产生自溶影响单细胞蛋白的生产从而更好的进行单细胞蛋白生产[9]，酿酒酵母生长曲线见图1。

由图1可知，在0～6 h处于延滞期，6～18 h处于对数生长期，18～30 h基本处于稳定期，随着培养时间的延长，部分菌体开始死亡，由于死亡的菌体和活的菌体不能够分离开来，所以在生长曲线上看不到菌的衰退期，而且在稳定期时，从总的吸光度值上看，是略呈增长的趋势，只是涨幅很小。因此当制备种子液的时候在同样培养条件下，培养到20 h左右即可。

2.2 培养基单因素筛选结果

2.2.1 糖蜜总糖含量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150r/min摇床培养24h，将糖蜜总糖含量分别设定为4%、6%、8%、10%、12%五个梯度，考察糖蜜总糖含量对菌体生物量的影响，结果见图2。

图2 糖蜜总糖含量对菌体生物量的影响Fig.2 Effect of molasses total sugar content on cell biomass

由图2可知，随着糖蜜总糖含量的增加，吸光度值也随之增加，当含量达到10%时增长变缓，经方差分析，12%与10%两组间差异不显著（P>0.05），所以糖蜜含量选为10%，从糖对菌体生物量的转化率和经济成本的角度考虑，高浓度糖转化率低，另外从糖浓度对酵母菌增殖的影响，高浓度糖在酵母增殖到稳定期时比低浓度糖过早表现出糖抑制作用，可能是因为高浓度糖使酵母菌能够快速达到对数期，伴随酵母菌快速增长的同时，代谢产物也快速积累，一些有抑制作用的代谢物快速达到其发挥抑制作用的浓度，从而阻碍酵母菌的增殖，相对初始糖浓度来说增大了残糖量，造成原料的浪费，增加了投入成本，综合以上各因素，选择10%的糖蜜含量作为适宜的碳源浓度。

2.2.2 氮源对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、在保证含氮量相同的前提下考察有机氮源（蛋白胨0.33%、干酪素0.35%、大豆蛋白胨0.51%、酪蛋白胨0.39%、胰蛋白胨0.38%）及无机氮源（硫酸铵0.23%和尿素0.1%）对菌体生物量的影响，结果见图3。

图3 不同氮源对菌体生物量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on cell biomass

由图3可知，无机氮源尿素对菌体生物量的增加效果最好，可能是因为微生物对无机氮源的吸收一般比有机氮源快，并且对稳定和调节发酵过程中的pH具有重要作用[10-11]，因此选择尿素作为氮源。

2.2.3 尿素添加量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、考察尿素添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）对菌体生物量的影响，结果见图4。

图4 尿素不同添加量对菌体生物量的影响Fig.4 Effect of urea addition on cell biomass

由图4可知，随着尿素添加量的增加，发酵液中氮源过量，发酵液的环境发生改变，抑制了酵母细胞的正常生长繁殖[12-13]，菌体生物量呈现先升高后下降的趋势，经单因素方差分析0.50%组与各组之间均差异显著（P<0.05），因此尿素的添加量选为0.5%。

2.2.4 磷酸二氢钾不同添加量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量为0.50%，考察磷酸二氢钾添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）对菌体生物量的影响，结果见图5。

图5 磷酸二氢钾不同添加量对菌体生物量的影响Fig.5 Effect of potassium dihydrogen phosphate addition on cell biomass

由图5可知，随着磷酸二氢钾添加量的增加，菌体生物量呈现下降趋势，与所报道的结果不一致[14]，可能是因为甜菜糖蜜是一种富含多种营养组分的物质，另外由于甜菜的产地和制糖工艺的不同，其中磷的含量也不同，另外由于试验目的不同，碳源所选糖蜜浓度不同，初始培养条件不同等多种因素综合在一起，使得糖蜜中所含的磷就足以满足当前条件下菌体生长的需要，额外再添加磷反而使其过量产生了抑制作用，因此本试验不添加磷酸二氢钾。

2.2.5 硫酸镁不同添加量对菌体生物量的影响[15]

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量为0.5%，考察硫酸镁添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）对菌体生物量的影响，结果见图6。

图6 硫酸镁不同添加量对菌体生物量的影响Fig.6 Effect of magnesium sulfate addition on cell biomass

由图6可知，0.05%的硫酸镁添加量与对照组相比对菌体生物量有促进作用，随着添加量的增加呈现出抑制作用，因此硫酸镁的添加量为0.05%。

2.2.6 酵母粉添加量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量为0.5%，硫酸镁添加量为0.05%，考察酵母粉添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）对菌体生物量的影响，结果见图7。

图7 酵母粉不同添加量对菌体生物量的影响Fig.7 Effect of yeast extract powder addition on cell biomass

由图7可知，随着酵母粉添加量的增加，菌体生物量呈现先升高后下降的趋势，经单因素方差分析0.1%组与对照之间差异不显著（P>0.05），因此酵母粉的添加量选为0.10%。2.2.7渗透压保护剂（甘氨酸）添加量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量为0.5%，硫酸镁添加量为0.05%，酵母粉添加量0.1%，考察甘氨酸添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）对菌体生物量的影响，结果见图8。

图8 甘氨酸不同添加量对菌体生物量的影响Fig.8 Effect of glycine addition on cell biomass

由图8可知，添加0.05%的甘氨酸对菌体生物量略有增加，其余几组随着甘氨酸添加量的增加，菌体生物量呈现逐渐下降的趋势，因此培养基中添加0.05%的甘氨酸。

2.2.8 红糖添加量对菌体生物量的影响

培养基初始pH5.0、培养基装液量20mL/100mL，30℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量为0.50%，硫酸镁添加量为0.05%，酵母粉添加量0.10%，甘氨酸添加量0.05%，考察红糖2%、4%、6%、8%、10%添加量对菌体生物量的影响，结果见图9。

图9 红糖不同添加量对菌体生物量的影响Fig.9 Effect of brown sugar addition on cell biomass

由图9可知，随着红糖添加量的增加，菌体的吸光度值也随之增加，并且经方差分析，8%和10%两组差异不显著（P>0.05），其余各组间均差异显著（P<0.05），因此红糖的添加量选为8%。

2.3 培养基条件优化正交试验

根据单因素试验结果，选取对菌体生物量提高影响较大的糖蜜、红糖、尿素、酵母粉4个因素L9（34）进行正交试验，因素与水平见表1，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表1 培养基条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for culture conditions optimization

表2 培养基条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for culture conditions optimization

由表2可知，RC＞RA＞RD＞RB，即尿素对菌体生物量的影响最为显著，然后依次为糖蜜、酵母粉、红糖。最佳发酵条件组合为A2B3C2D3，即10%糖蜜总糖含量，10%红糖，0.50%尿素，0.50%酵母粉。以此培养基成分进行验证试验，3次重复试验结果表明，该组合确为该株菌的最适培养基，在此优化条件下培养菌体，酵母菌体干质量可达到16.83 g/L。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3方差分析结果可知，在试验设定的范围内红糖添加量对菌体生物量的影响差异不显著，而糖蜜总糖含量、尿素含量和酵母粉含量对菌体生物量有显著影响。

3 结论

酵母菌是一类单细胞微生物，具有个体大、易分离、易培养、蛋白质含量高、代谢产物多等特点，在蛋白饲料严重不足的今天，酵母及其培养物的广泛应用，对我国畜牧、饲料生产有重大意义。本研究对供试菌株进行了培养基配方的研究，经单因素和正交试验筛选得到的培养基组成为总糖含量为10%糖蜜、10%红糖、0.50%尿素、0.50%酵母粉、0.05%硫酸镁、0.05%甘氨酸。在此条件下菌体干质量可以达到16.83 g/L。

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Aerobic fermentation culture medium ofSaccharomyces cerevisiae

ZHAO Xiaoli1,2,ZHEN Yuguo1,2*,WANG Lanhui1,YI Xiaofei1

(1.JAU-Borui Dairy Science and Technology R&D Center,Changchun 130118,China;

2.Technology Center of Changchun Borui Feed Group Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Yeast strain selected in lab was used as testing strain and beet molasses was used as carbon source to produce yeast.Single factor and orthogonal experiment was used to optimize laboratoryshaking flask fermentation medium formula,and the optimized condition was as follows:10%molasses of total sugar content,10%brown sugar,0.50%urea,0.50%yeast powder,0.05%MgSO4and 0.05%glycine.Under this condition,the dry cell weight reached 16.83 g/L.

beet molasses;yeast;culture medium

Q93-33

A

0254-5071（2014）07-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.009

2014-06-07

吉林省重大科技攻关项目（2012ZDGG006）

赵小丽（1981-），女，硕士，研究方向为动物营养与饲料。

*通讯作者：甄玉国（1970-），男，副教授，博士，研究方向为动物营养。