葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的Candida tropicalis过量表达及其对木糖醇合成代谢的影响

高雪楠，张 婵,，尹 胜，张秋晨，王成涛,,，徐宝财,

（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

木糖醇是甜度最高的糖醇，其甜度相当于蔗糖，热量只有蔗糖的40%，并具有清凉感，因其具有防龋齿、洁齿、润喉、改善胃肠功能等特点，已广泛应用于口香糖、胶姆糖、太妃糖、软糖、巧克力、果冻、冷饮、口含片、漱口剂、润喉药物、止咳糖浆中；木糖醇代谢不需要胰岛素调节，不会导致人体血糖的剧烈变化，可作为糖尿病人的甜味剂；木糖醇可促进肝糖元合成，减少脂肪和肝组织中蛋白质消耗，具有改善肝功能和抗脂肪肝的作用，可作为肝炎、高血压、高血脂和年老体弱病人的专用输液剂。近年来，随着人们生活质量提高，木糖醇的健康功效越来越多被消费者所接受[1-3]。全球木糖醇年需求量10万t以上，我是世界木糖醇的主要生产和出口国，年产量占世界总产量约40%，我国木糖醇年需求量2.5万t以上。目前木糖醇主要通过化学合成制造，需使用有毒性的镍催化剂和高压氢气，要求原料木糖的纯度高，工艺复杂、安全性差、生产成本高、副产物成分复杂，环境污染严重，不符合节能减排、可持续发展的社会要求，成为目前国家严格限制发展的行业[4]。

已有研究发现，酵母菌可转化木糖生成木糖醇，该生化过程的原料木糖无需纯化制备，反应条件温和，无需耐高压设备，此“清洁”、“绿色”的生产技术成为近年研究热点[5-7]。木糖醇的生物合成与磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)紧密相连，需要木糖还原酶、还原性辅酶NADPH等参与（木糖＋，此还原反应是木糖醇能否顺利连续合成的关键步骤[8-10]，NADPH主要是通过PPP途径产生，当PPP途径受到破坏，木糖醇产量则明显降低[11]。关于增强PPP途径的代谢通量分配及NADPH的再生，改善PPP途径以提高木糖醇产率的研究已有一些报道[12-19]。Kang等[15]研究认为，以木糖为底物发酵时，PPP途径的多种酶活力远远高于以葡萄糖为底物时的情况。Choi等[16]研究认为，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphatedehydrogenase，G6PDH）是PPP途径中催化生成NADPH的关键性调控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供应量的有效手段之一。Kwon等[17]将Saccharomyces cerevisiae的G6PDH编码基因ZWF1导入遗传改造后含外源木糖脱氢酶基因的酿酒酵母中，改造后重组菌株中G6PDH的酶活力提高了近6倍，发酵液中木糖醇浓度与只导入木糖脱氢酶基因的菌株相比，木糖醇产率提高了25%，表明导入编码G6PDH的基因能够显著提高木糖醇产率。热带假丝酵母（Candida tropicalis）也是目前木糖醇生产研究广泛应用的菌株[6-7,15-16]。本实验以Candida tropicalisCT16为模式菌株，将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因G6PDH进行克隆、过量表达，构建高产稳定表达的木糖醇工程菌株，研究其对木糖醇合成代谢的影响，为木糖醇生物合成制造提供优良菌株和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C.tropicalisCT16 本实验室保存；Escherichia coliTOP10感受态细胞 天根生化科技（北京）有限公司；酵母表达载体pYES-pgk 本实验室构建保存。

酵母基因组提取试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、抗生素G418 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker北京全式金公司；EXTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶 日本TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨和蛋白胨英国Oxoid公司；木糖山东福田科技集团；木糖醇（分析纯）美国Sigma公司；NADP+、NADPH 半夏科技公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

Luria-Bertani （LB）培养基（g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物5、NaCl 10；YPD （yeast extract peptone dextrose）培养基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10；木糖醇发酵培养基（g/L）：木糖100、葡萄糖10、蛋白胨 1、酵母提取物0.5。

1.3 引物设计

根据GenBank中报道的C.tropicalis葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd编码序列（Accession No.XM_002548907），利用DNAMAN软件设计引物。

g6pd基因扩增引物：F-g6pd：5’-GG GGT ACC ATG TCT TAT GAT TCA TTC GG-3’（酶切位点KpnⅠ）；R-g6pd：5’-GC TCT AGA TTA GAT CTT ACC TTT GAC AT-3’（酶切位点XbaⅠ）。酵母转化子鉴定引物：F-T7：5’-CAG CTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；R-CYC1：5’-TATAATACCGGTGTTGGCCGATTCATTATT-3’。

1.4 g6pd基因的PCR扩增

以C.tropicalisCT16的基因组为模板，设计引物F-g6pd和R-g6pd进行PCR扩增。反应体系如下：ExTaq聚合酶0.3 μL、模板2 μL、上下游引物（10 mmol/L）各1 μL、dNTP混合物（2.5 mmol/L）2 μL、10×Ex TaqBuffer 2.5 μL、ddH2O补至25 μL。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1.5 min，30个循环，72℃ 10 min。凝胶电泳检测PCR产物。将纯化的PCR产物送至上海生工（生物）工程技术有限公司测序，DNAMAN软件和NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站在线BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列分析和同源性搜索比对。

1.5 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建

表达载体pYES-pgk-g6pd的构建如图1所示。KpnⅠ和XbaⅠ分别对g6pd基因片段和pYES-pgk进行双酶切，纯化回收的酶切片断经T4 DNA Ligase于16℃连接过夜，连接产物转化E.coliTOP10感受态细胞，在添加抗生素G418的LB平板上筛选阳性重组子，37℃培养过夜，提取阳性菌落质粒鉴定。

图1 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建策略Fig.1 Construction strategy of the expression vector pYES-pgk-g6pd

1.6 g6pd基因在C.tropicalis中的过量表达

利用LiAc/ssDNA/PEG方法将重组表达载体pYES-pgk-g6pd转化至C.tropicalisCT16感受态细胞中，在添加G418的YPD平板上筛选阳性重组子。提取重组子质粒，设计引物F-T7和R-CYC1进行PCR扩增，回收目的条带，酶切、测序鉴定重组子。C.tropicalis感受态细胞的制备及其转化方法参照文献[20]。

1.7 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶活力检测

取30 h的发酵液，1 100 r/min、4℃离心20 min，灭菌蒸馏水洗涤、重悬、再离心，菌体重悬于缓冲液体系：10 mmol/Lβ-巯基乙醇、2 mmol/L甘氨酸、0.071 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），并加入玻璃珠（体积比1∶1）振荡破碎，离心取上清液（粗酶液）用于酶活力分析[13]。

反应体系（2.56 mL）：2 mL 70 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.4 mL 35 mmol/L MgCl2、20 μL 131 mmol/L NADP+、40μL 500 mmol/L 6-磷酸-葡萄糖、0.1 mL粗酶液。30 ℃、340 nm测定NADPH吸收值变化。340 nm波长处每隔30 s测定一次吸光度，反应10 min，以吸光度y与NADPH浓度x（mmol/L）作标准曲线。G6PDH酶活力定义：反应体系中每分钟还原1 μL NADP+所需的酶量为1U。

1.8 发酵实验及木糖和木糖醇的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测

将C.tropicalisCT16野生型和重组菌株C.tropicalisSYG5 以3%的接种量分别接种到木糖醇发酵培养基，30 ℃、200 r/min振荡培养，每隔10 h取发酵液样品，8 000 r/min离心4 min，HPLC检测木糖及木糖醇浓度。HPLC（岛津LC-20A）检测条件为：色谱柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），示差折光检测器，柱温45 ℃，流动相0.5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd的PCR扩增

以C.tropicalisCT16基因组为模板，扩增目的基因片段，电泳、测序。如图2所示，得到的PCR产物单一DNA片段大小约为1.5 kb，与预期相符。将纯化的PCR产物测序，经DNAMAN软件和NCBI比对，与GenBank中报道的C.tropicalis基因g6pd（Accession No.XM_002548907）相似度达100%，表明g6pd基因扩增正确。

图2 g6pd基因PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene

2.2 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建

使用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定重组质粒，电泳检测如图3所示。重组质粒pYES-pgk-g6pd经双酶切得到6.0 kb和1.5 kb的清晰条带，与预期相符，证明表达载体构建正确。

图3 KKppnnⅠ+XbaⅠ双酶切重组质粒pYES-pgk-g6pd电泳图Fig.3 Electrophoresis of the plasmid pYES-pgk-g6pd double digested with KpnⅠ+ XbaⅠ

2.3 重组C.tropicalis的筛选、鉴定及酶活力分析

表达载体pYES-pgk-g6pd转入C.tropicalisCT16后，在含抗生素G418的YPD平板上进行筛选。从平板上挑取长势较好的单菌落，在含1 mg/mL G418的培养基培养，筛选获得阳性转化子C.tropicalisSYG5。

提取C.tropicalisSYG5质粒，设计引物F-T7和R-CYC1-Age PCR扩增，电泳检测结果如图4所示。从转化子（工程菌）SYG5中扩增g6pd基因表达盒（包括启动子、g6pd基因编码序列和终止子）的特异性条带，大小约为1.9 kb，与预期相符，且测序验证正确，表明重组质粒pYES-pgk-g6pd已转入C.tropicalisCT16。

分析30 h发酵粗酶液的G6PDH酶活力，以吸光度y与NADPH浓度x（mmol/L）作标准曲线，获得方程y=0.005 5x－0.007 3（R2＝0.999 9）。C.tropicalisCT16 G6PDH的酶活力为786 U/L，C.tropicalisSYG5的G6PDH酶活力为3 145 U/L，说明g6pd基因的过量表达能显著增强C.tropicalisG6PDH的活性。

图4 重组菌株C.tropicaalis SYG5中g6pd基因表达盒的PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene expression cassette from the recombinant strain C.tropicalis SYG5

2.4 野生菌和工程菌转化木糖醇能力比较

将野生型菌C.tropicalisCT16和重组工程菌C.tropicalisSYG5分别接种于木糖醇发酵培养液。如图5所示，在此实验条件下发酵液中木糖和木糖醇能较好的分离，且峰型较好，无前延、拖尾、重叠，其木糖和木糖醇的特征峰分别出现于11.354 min和13.161 min。

图5 木糖和木糖醇的HPLC分析Fig.5 HPLC analysis of xylose and xylitol

如图6所示，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇生成量随发酵时间延长逐渐增多，摇瓶发酵62 h时木糖醇质量浓度达到最高值79.90 g/L，木糖醇产率为1.29 g/（L·h）；野生菌株CT16发酵80 h时，木糖醇生成量达到峰值，约为71.08 g/L，产率为0.89 g/（L·h）。与野生型菌株相比，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇产量提高12.41%，产率提高44.94%。发酵62 h时，工程菌SYG5的木糖几乎完全消耗，木糖醇呈现最高质量浓度，随后木糖醇消耗，导致其质量浓度下降；野生菌C.tropicalisCT16发酵80 h时木糖醇浓度才达到最大值，但其峰值明显低于工程菌SYG5。上述结果表明，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd的过量表达，可以显著提高C.tropicalis的PPP途径的G6PDH酶活力、代谢通量分配，增加NADPH供应量，加速木糖醇合成速率和产量，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在木糖醇生物合成过程中发挥关键性作用。

图6 C.tropicalis CT16与C.tropicalis SYG5摇瓶发酵实验中的木糖和木糖醇质量浓度动态变化曲线Fig.6 Dynamic curves of xylitol production and xylose consumption in C.tropicalis CT16 and C.tropicalis SYG5 during fermentation on xylose and glucose in shaking flasks

3 结 论

本实验构建了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd基因的重组表达载体pYES-pgk-g6pd，并将其过量表达于C.tropicalisCT16，探索g6pd基因过量表达对木糖醇合成代谢影响。结果表明，发酵62 h时，携带重组质粒pYES-pgk-g6pd的工程菌C.TropicalisSYG5摇瓶发酵木糖醇产量为79.90 g/L，与野生菌株相比，木糖醇产量提高12.41%，产率提高44.94%；g6pd基因的过量表达，增强了G6PDH的酶活力，提高了菌体NADPH供应量和还原力，显著促进木糖醇生物合成的代谢流量分配，提高了木糖醇产量和木糖产率。因此，G6PDH是木糖醇生物合成途径中的关键酶，构建的高产木糖醇工程菌为其产业化转化提供了重要基础。

[1]EMODI A.Xylitol: its properties and food applications[J].Food Technology, 1978, 32(1): 28-32.

[2]MAKINEN K K.Xylitol and oral health[J].Advance in Food Research, 1979, 25: 137-158.

[3]PRAKASHAM R S, RAO R S, HOBBS P J.Current trends in biotechnological production of xylitol and future prospects[J].Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 2009, 3(1): 8-36.

[4]成英, 闫书磊, 明立雪.木糖醇的生产工艺及应用研究进展[J].甘肃石油和化工, 2008, 22(3): 18-21.

[5]KO C H, CHIU P C, YANG C L, et al.Xylitol conversion by fermentation using five yeast strains and polyelectrolyte-assisted ultrafiltration[J].Biotechnology Letters, 2008, 30(1): 81-86.

[6]S NCHEZ S, BRAVO V, GARC A J F, et al.Fermentation ofD-glucose andD-xylose mixtures byCandida tropicalisNBRC 0618 for xylitol production[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(5): 709-716.

[7]IN S.Hydrolysate detoxification with activated charcoal for xylitol production byCandida guilliermondii[J].Biotechnology Letters, 2001,23(20): 1681-1684.

[8]MOREIRA DOS SANTOS M, THYGESEN G, K TTER P, et al.Aerobic physiology of redox-engineeredSaccharomyces cerevisiaestrains modified in the ammonium assimilation for increased NADPH availability[J].FEMS Yeast Research, 2003, 4(1): 59-68.

[9]KIM J H, HAN K C, KOH Y H, et al.Optimization of fed-batch fermentation for xylitol production byCandida tropicalis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2002, 29(1): 16-19.

[10]NOLLEAU V, PREZIOSI-BELLOY L, NAVARRO J M.The reduction of xylose to xylitol byCandida guilliermondiiandCandida parapsilosis: incidence of oxygen and pH[J].Biotechnology Letters,1995, 17(4): 417-422.

[11]LEATHERS T D, DIEN B S.Xylitol production from corn fibre hydrolysates by a two-stage fermentation process[J].Process Biochemistry, 2000, 35(8): 765-769.

[12]OH Y J, LEE T H, LEE S H, et al.Dual modulation of glucose 6-phosphate metabolism to increase NADPH-dependent xylitol production in recombinantSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 47(1): 37-42.

[13]CHIN J W, KHANKAL R, MONROE C A, et al.Analysis of NADPH supply during xylitol production by engineeredEscherichia coli[J].Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102(1): 209-220.

[14]FERNANDES S, TUOHY M G, MURRAY P G.Cloning,heterologous expression, and characterization of the xylitol andL-arabitol dehydrogenase genes,TexdhandTelad, from the thermophilic fungusTalaromyces emersonii[J].Biochemical Genetics,2010, 48(5/6): 480-495.

[15]KANG H Y, KIM Y S, KIM G J, et al.Screening and characterization of flocculent yeast,Candidasp.HY200, for the production of xylitol fromD-xylose[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 15(2): 362-367.

[16]CHOI J H, MOON K H, RYU Y W, et al.Production of xylitol in cell recycle fermentations ofCandida tropicalis[J].Biotechnology Letters,2000, 22(20): 1625-1628.

[17]KWON D H, KIM M D, LEE T H, et al.Elevation of glucose 6-phosphate dehydrogenase activity increases xylitol production in recombinantSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 43(1): 86-89.

[18]VERHO R, LONDESBOROUGH J, PENTTIL M, et al.Engineering redox cofactor regeneration for improved pentose fermentation inSaccharomyces cerevisiae[J].Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 5892-5897.

[19]AHMAD I, SHIM W Y, JEON W Y, et al.Enhancement of xylitol production inCandida tropicalisby co-expression of two genes involved in pentose phosphate pathway[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2012, 35(1/2): 199-204.

[20]安伯格 D C.酵母遗传学方法实验指南[M].霍克克, 译.2版.北京:科学出版社, 2009: 98-99.