牛肉成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响

陈茜茜，黄 明，周光宏，徐幸莲

(南京农业大学食品科技学院，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095)

动物的肌肉组织在屠宰后的成熟过程中会发生结缔组织松散、Z线降解和肌原纤维蛋白及细胞骨架蛋白水解等变化，使肌肉的僵直解除、持水力加强、嫩度提高，从而很大程度改善了肉的食用品质[1]。目前研究发现骨骼肌中内源酶与肉类的成熟嫩化过程联系密切，主要包括钙激活酶体系、溶酶体组织蛋白酶类和细胞凋亡酶体系[2-3]。其中钙激活酶在肉类宰后成熟过程中的重要作用已被大量的研究报道所证实。有研究发现用钙激活酶在体外孵育肌原纤维蛋白能完全模拟自然成熟条件下伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白-T等蛋白的降解情况[4]。向鸡肉中注射钙激活酶抑制剂后，部分关键肌原纤维蛋白的降解显著降低，鸡肉的嫩度变差[5]。成熟过程中不同物种之间的嫩化程度差异与钙激活酶抑制蛋白和钙激活酶的表达量之比之间也被证实存在负相关性[6]。在肉类的宰后成熟过程中，钙激活酶对部分关键肌原纤维蛋白如伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白及肌钙蛋白-T等的降解作用改善了肉的嫩度、风味、持水力等品质[7]。由此可知，钙激活酶在肉类成熟机制中起着极为重要的作用[8]。

肌肉组织中富含亚铁血红素、不饱和脂肪酸、金属催化剂等促氧化因子，因此在肉类宰后成熟、加工、运输及贮藏过程中，肌肉组织极易被氧自由基攻击。现有研究均集中于肌肉组织中的脂肪和蛋白质氧化对肉的食用品质如肉色、嫩度、持水力、风味及营养价值的影响。如脂肪氧化会造成红肉的肉色褪色和酸败，形成不良风味[9]；而添加一些抗氧化剂如VC、VE则可以抑制蛋白质氧化而使肉色保持鲜红[10]；经过辐照处理的牛肉在宰后成熟过程中剪切力明显高于对照组，即嫩度降低[11]；纯化的肌原纤维蛋白在体外被H2O2氧化后持水力降低[12]；赖氨酸、精氨酸等必需氨基酸的结构在蛋白质氧化过程中会被不可逆转的修饰，因此肉类蛋白质的营养价值也相应降低[13]。

但是，氧化引起这些品质变化的具体机制尚未被明确阐述，仍需要深入的研究。大部分研究主要围绕氧化对肌原纤维蛋白降解的影响。有研究将纯化的肌原纤维蛋白和纯化 -钙激活酶氧化后，再分别与 -钙激活酶和肌原纤维蛋白孵育，结果显示与嫩度密切相关的钙激活酶-T的降解均被抑制[14-15]。钙激活酶是一类半胱氨酸蛋白酶，其活性位点上的半胱氨酸残基是各类氨基酸中最易被氧化的[13,16]，且与羟基自由基的反应活性较强[17]。据此推断氧化是通过改变钙激活酶的中心活性基团进而改变其对肌原纤维蛋白的降解作用，然而这方面的报道较少，因此研究氧化对钙激活酶结构和活性的影响十分必要。本实验对牛肉体外注射氧化剂，通过活性电泳(casein zymography)和蛋白免疫印迹（Western blotting）研究钙激活酶在牛肉自然成熟过程中的活性及降解变化，旨在阐明氧化条件下的钙激活酶和关键肌原纤维蛋白之间的作用机制，为全面阐述氧化对肉类成熟的影响机制提供科学依据，并为实际生产过程中肉类品质的改善提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

取3头年龄约2.5岁、活体质量约500 kg、宰后20 min内的鲁西黄牛背最长肌，牛来源于安徽翰森荷金来屠宰场。

Clone 9A4H8D3鼠单克隆抗μ-钙激活酶 美国Abcam公司；过氧化物酶标记的抗鼠免疫球蛋白 美国Bio-Rad公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜 美国Millipore公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒和酶放大化学发光免疫分析（ECL）试剂盒 美国Thermo公司：牛血清白蛋白 美国Promega 公司；酪蛋白 美国Sigma公司；FeSO4、H2O2、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、TritonX-100均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

U410型超低温冰柜 日本日立公司；Spectramax M2酶标仪 美国MD公司；AUY120型电子分析天平日本Shimadzu公司；Ultra Turrax T25高速匀浆器 德国Basis公司；HANNA 211 型pH计 意大利Hanna公司；Beckman冷冻离心机 美国Avanti J-E公司；小型垂直电泳系统和凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

取3条背最长肌作为3组平行，每条背最长肌切出20块，并将这20块随机平均分为4组，分别注射4个浓度的氧化剂：0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O1组）、50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O2组）、200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O3组）、500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O4组）。注射量为肉质量的5%。随后立即真空包装。另外两条背最长肌作相同处理。将样品置于4 ℃存放0、1、3、7、14 d后取样，每个处理均取3个样。

1.3.1 钙激活酶提取与电泳样品制备

参照Camou等[18]的方法，取1 g已剔除结缔组织的肉样，加入3倍体积的提取液（100mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、体积分数0.05%β-巯基乙醇，pH 8.3）。使用高速匀浆机在4 ℃、15 000 r/min条件下匀浆30 s，每隔10 s间隔10 s。然后在20 000×g、4 ℃条件下离心30 min。取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度并统一调整。

活性电泳样品制定：按1∶1（V/V）的比例加入样品处理液（150 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、0.75%β-巯基乙醇、0.02%溴酚蓝，pH 6.8），随即放入-80 ℃冰箱备用。

SDS-PAGE电泳样品制定：按1∶1（V/V）的比例加入样品处理液（30 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3%SDS、20%甘油、8%巯基乙醇、0.04%溴酚蓝，pH 8.0），50 ℃水浴20 min，随即放入-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 活性电泳[19]测定钙激活酶活性

本实验中使用0.75 mm的胶板，12.5%的分离胶（1.5 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL过硫酸铵，0.05 g/100 mL四甲基乙二胺（TEMED），2.1 mg/mL酪蛋白）和4%的浓缩胶（125 mmol/L T r i s-H C l、p H 6.8，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL过硫酸铵，0.05 g/100 mLTEMED）。恒压100 V预跑15 min后上样40 μg蛋白，继续跑5 h。电泳完成后，用孵育液洗胶3次，每次20 min，随后将胶放入孵育液室温下反应16 h。考马斯亮蓝R-250染色液染色1 h，脱色过夜后用GelDox凝胶成像系统获取图像。

1.3.3 蛋白免疫印迹法[20]分析钙激活酶的降解

采用1.0 mm的胶板，10%的分离胶（1.5 mol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL SDS，0.05 g/100 mL过硫酸铵，0.05 g/100 mL TEMED）和4%的浓缩胶（0.5mol/L Tris-HCl、pH 6.8，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL的SDS，0.05 g/100 mL过硫酸铵，0.05 g/100 mL TEMED进行SDS-PAGE电泳，上样量为40 μ g，恒压80 V跑20 min后，恒压120 V继续跑90 min。电泳结束后，采用湿法转印，将凝胶置于转印液（20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、15%甲醇）中恒流200 mA转印90 min，待蛋白转印到PVDF膜后，将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TTBS溶液（500 mmol/L NaCl、30 mmol/L Tris-HCl、0.05%吐温-20，pH 7.5）中于室温封闭2 h。然后将膜与1∶500稀释的鼠单克隆抗μ-钙激活酶在4 ℃条件下反应过夜后，用Tris-吐温盐缓冲液（全称，TTBS）漂洗4次，每次10 min。再与按1∶5 000稀释的过氧化物酶标记的抗鼠免疫球蛋白溶液室温反应2h，继续用TTBS漂洗4次。最后用ECL法显色。

1.3.4 μ-钙激活酶的半定量分析

采用Quanity-One分析软件对蛋白免疫印迹条带光密度值进行半定量；μ-钙激活酶免疫印迹条带相对光密度值分别为目标条带光密度值与宰后0 d未氧化处理组蛋白条带光密度值的比值。

1.4 统计分析

每组样品做3组平行，采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，不同氧化处理组和不同成熟时间之间的差异使用邓肯多重比较，P＜0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 体外氧化对牛肉自然成熟过程中钙激活酶活性的影响

通过活性电泳分析在氧化条件下牛肉宰后成熟过程中钙激活酶的活性变化（图1），并对μ-钙激活酶的活性条带进行半定量，得到其相对光密度值（图2）。宰后0 d和1 d时，氧化对µ-钙激活酶和m-钙激活酶的活性几乎没有影响，各氧化组的相对光密度值均无显著差异（P＞0.05）。成熟3 d时，μ-钙激活酶活性较0 d时有所降低，此时高氧化组的μ-钙激活酶活性条带的相对光密度值为68.38%，较未氧化组有显著差异（P＜0.05）。7 d以后，活性电泳图显示，随着氧化剂浓度的提高，μ-钙激活酶活性受到抑制。当氧化剂浓度为50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl时，μ-钙激活酶活性与未氧化组相比受到轻微抑制，而当氧化剂浓度为500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl时，μ-钙激活酶活性被显著抑制，此时m-钙激活酶活性条带与0、1、3 d相比几乎没有变化。牛肉宰后成熟14 d后，活性电泳仅能检测到μ-钙激活酶的微弱活性，且μ-钙激活酶活性随着氧化剂浓度的提高而越来越弱，高氧化组的μ-钙激活酶活性条带的相对光密度值仅为5.97%，与其他各组相比均有显著差异（P＜0.05）。结果显示氧化能够抑制牛肉宰后成熟过程中μ-钙激活酶的活性，这与Carlin等[21]的研究结果一致，他们发现当pH值范围为6.0～7.5，离子强度分别为165 mmol/L和295 mmol/L时，H2O2的加入能显著抑制猪肉中μ-钙激活酶的活性。同时，随着牛肉宰后成熟时间的增长，未氧化组的钙激活酶活性逐渐降低，尤其成熟14 d后的活性条带非常微弱（图1），因此宰后储藏时间过长会对钙激活酶活性产生较大影响。

图2 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中 -钙激活酶活性条带的相对光密度值的影响Fig.2 Relative optical density of μ-calpain activity under various oxidative conditions during beef postmortem ageing

图1 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中μ-钙激活酶和m-钙激活酶活性影响的活性电泳分析Fig.1 Casein zymography analysis showing the effect of variable oxidative conditions on the activity of μ-calpain and m-calpain during beef postmortem ageing

另外活性电泳结果显示，牛肉宰后成熟14 d时，当氧化剂浓度为0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl时，出现了m-钙激活酶降解片段的活性条带，而氧化剂浓度升高后，此条带消失，因此可以推测氧化抑制了m-钙激活酶的降解。这与Rowe等[22]的研究结果类似，他们发现在其自然成熟过程中辐照组的m-钙激活酶降解片段的活性条带消失。

2.2 体外氧化对牛肉自然成熟中钙激活酶降解的影响

图3 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中80 kD μ-钙激活酶降解影响的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis showing the effect of various oxidative conditions on μ-calpain autolysis during beef postmortem ageing

本实验中使用的鼠单克隆抗μ-钙激活酶能够特异性识别80 kD的μ-钙激活酶片段，通过蛋白免疫印迹法分析μ-钙激活酶降解情况（图2）；采用QuatityOne分析软件对蛋白印迹条带光密度值进行半定量，得到不同成熟时间各氧化组μ-钙激活酶的相对光密度值（表1）。μ-钙激活酶的Western-blotting结果（图3）显示牛肉在宰后0 d和1 d时，几乎没有发生降解；在宰后成熟3 d后，分子质量为80kD的μ-钙激活酶条带变浅，此时经高浓度氧化剂处理的μ-钙激活酶的相对光密度值为76.42%。7 d以后，μ-钙激活酶免疫印迹条带随氧化浓度升高而逐渐变浅，不同氧化处理组的相对光密度值分别为52.28%、49.64%、44.21%、37.56%；宰后成熟14 d时，μ-钙激活酶发生了更大程度的降解，各组相对光密度值分别达到30.08%、27.73%、20.11%、9.75%，即当氧化剂浓度为200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl时，μ-钙激活酶降解与未氧化组相比差异显著（P＜0.05，表1）。以上结果表明当宰后自然成熟的时间相同时，经高浓度氧化剂处理的牛肉的 -钙激活酶的相对光密度值均显著高于未氧化处理组，因此高浓度氧化剂在牛肉的宰后成熟过程可以显著促进μ-钙激活酶的降解。而 -钙激活酶的降解在牛肉的宰后成熟过程中持续进行，且随着贮藏时间的延长而加强，表1显示牛肉在自然成熟0、1、3、7、14 d时，相同氧化处理组之间的μ-钙激活酶相对光密度值均有显著性差异，这说明贮藏时间对钙激活酶的影响大于氧化对其的影响。

结合活性电泳结果可知，μ-钙激活酶的活性随着其降解程度的增强而降低。曾有研究结果表明牛肉骨骼肌中μ-钙激活酶的活性增强，同时其降解被抑制[11]，这与本实验结果类似。μ-钙激活酶的80 kD亚基包括蛋白酶活性结构域和钙结合结构域，μ-钙激活酶一旦发生降解，活性结构域便会被破坏，从而影响其活性。μ-钙激活酶的激活所需的Ca2+浓度与自动降解所需浓度接近，因此μ-钙激活酶由80 kD向更小亚基如78 kD和76 kD的自动降解为一直以来被认为是μ-钙激活酶激活的标志，而μ-钙激活酶被激活后的持续迅速降解导致了其活性的降低[23]。

表1 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中 -钙激活酶相对光密度值的影响Table 1 Relative optical density of -calpain under various oxidative conditions during beef postmortem ageing %

3 结 论

本实验结果表明，在牛肉的宰后成熟过程中，氧化能促进80 kD的μ-钙激活酶降解并抑制其活性，当氧化剂浓度为500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl时，μ-钙激活酶的活性和降解较未氧化组均有显著差异；并且当牛肉宰后成熟7 d以后，氧化对钙激活酶的影响较成熟1、3 d相比影响更大。这说明在肉类宰后成熟及贮藏过程中，辐照、冷冻解冻、高氧包装等因素导致的氧化反应会促进μ-钙激活酶降解并抑制其活性。同时本实验还揭示了牛肉的宰后储藏时间对钙激活酶降解及活性影响大于注射氧化剂对其的影响。μ-钙激活酶作为肉类宰后嫩度改善的主要贡献者，它的活性变化必然对肉类宰后相关食用品质如嫩度、风味等产生不利影响。因此本实验结果为肉类宰后成熟过程中食用品质的改善提供了科学依据。

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