乳酸乳球菌KLDS4.0325的B族维生素生物合成途径分析

杨晓春，王玉堂，霍贵成

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

维生素是所有生物体新陈代谢所必需的微量营养因子。它们一般作为细胞内辅酶的前体物质，可以调节细胞内重要的生化反应。人类自身只能合成少量的维生素，所以必须从外界获取大量的维生素（例如饮食）[1-2]。尽管大多数维生素存在于各种食物当中，但是包括发达国家在内的许多国家和地区仍然存在着维生素缺乏的现象，这不仅仅是由于食物摄取不足，饮食不均衡也是一个非常重要的原因。常见的B族维生素包括硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素、叶酸和钴胺素等。每一种B族维生素的化学性质明显不同，它们可以在人体内协同作用来调节重要的新陈代谢过程，像能量的 产生和血红细胞的形成等。

蔬菜和乳制品是人类B族维生素的主要来源[3]。牛乳中几乎含有所有种类的维生素，尤其是B族维生素。研究发现，平均每升牛乳中叶酸含量为20～50 μg[4]，发酵乳制品，尤其是酸奶含有更多的叶酸。与蔬菜来源的B族维生素相比，乳制品和其他发酵产品中的B族维生素具有一定的优势。另外，许多发酵乳制品比原料乳中含有更高浓度的B族维生素（叶酸、核黄素等）。这就很好的解释了一些作为乳制品起始发酵剂的菌株，例如嗜热链球菌、乳酸乳球菌等，在从头合成一定量的B族维生素后，能够释放出更多的B族维生素到培养基中的原因[5-7]。

乳酸乳球菌KLDS4.0325是由东北农业大学“教育部乳品重点实验室”从中国新疆牧民家庭自制的酸马奶中分离得到的1株乳酸乳球菌。经常规实验发现，该菌株具有较强的叶酸合成能力。为了在基因水平上挖掘该菌株的B族维生素合成潜力，对该菌株进行了全基因组鸟枪法测序，并利用生物信息学手段对其B族维生素合成途径进行了比较分析。乳酸菌代谢可以产生B族维生素的这一性质不仅可以为发酵乳制品中添加一系列天然B族维生素提供了良好的方式[8]，同时也为菌株功能的挖掘提供了新的研究思路[9]。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

乳酸乳球菌KLDS4.0325来自于东北农业大学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心（KLDS-DICC）。它是从中国新疆牧民家庭自制的酸马奶中分离得到的1株乳酸乳球菌。

脱脂乳培养基：脱脂乳100g，蒸馏水1L，pH值自然。

1.2 试剂

脱脂乳 Nordmilchag公司；乙醇、异丙醇 德州康泰消毒制品有限公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生物技术（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨 英国Oxoid公司；葡萄糖、吐温 美国Sigma公司；磷酸氢二钾、柠檬酸二氢钾、乙酸钠 天津市科密欧试剂公司；硫酸镁、硫酸锰 天津市天力化学试剂公司；琼脂粉、溶菌酶 Solabiro公司；纯净水哇哈哈集团有限公司。

TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0，于121 ℃、20 min灭菌备用。

1.3 仪器与设备

HVE-50电热蒸汽自动灭菌锅 Hirayama公司；CJ-2D超净工作台 天津泰斯特仪器有限公司；全系列Eppendorf移液器 德国Eppendorf公司；SPX-150B生化培养箱 上海佳胜实验设备有限公司；GL-20G-II离心机 上海安亭科学仪器厂；DYY-10C电泳仪 北京六一仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培养及总DNA的提取

将冷冻干燥保藏的乳酸乳球菌KLDS4.0325以体积分数1%的接种量转接至脱脂乳中进行培养24 h[10]。再将菌株于MRS培养基转接两次，使菌株活力得到充分恢复。

菌株总基因组DNA的提取参照细菌基因组提取试剂盒说明进行。DNA提取完成后，取2～5 L DNA进行0.8%琼脂糖电泳，以检测提取DNA的完整性和质量。最后，送至深圳华大基因科技服务有限公司进行全基因组序列的测定。

1.4.2 基因组的测序、组装及注释

乳酸乳球菌KLDS4.0325经全基因组鸟枪法进行测序后，利用SOAOdono软件进行序列拼接。所有的操作都按照标准程序进行操作[11-15]。利用GeneMark和Glimmer软件进行基因预测[16-17]。将获得的全基因组序列利用BLAST[18-19]工具扫描相应的蛋白数据库（例如非冗余数据库和全球通用蛋白数据等）进行序列的注释。乳酸乳球菌KLDS4.0325的全基因组序列已经上传到了GenBank数据库中，登录号为：CP006766。

1.4.3 生物信息学分析

利用ORFfinder预测开放阅读框[20]。维生素的一般合成途径是从京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库中获得的。从Uniport蛋白数据库获得了B族维生素合成途径的蛋白序列后，在Linux操作系统内针对乳酸乳球菌KLDS4.0325全基因组序列建库，使用BLASTp本地比对程序将这些获得的蛋白序列针对数据库进行比对搜索[21]。9株参考菌株在B族维生素合成途径中涉及的酶的序列信息是从GenBank数据库中获得的。这些菌株包括Lactococcus lactissubsp.lactisIL1403（缩写LLA，登录号AE005176）、Lactococcus lactissubsp.lactisKF147（LLK，CP001834）、Lactococcus lactissubsp.lactisCV56 （LLT，CP002365）、Lactococcus lactissubsp.lactisIO-1 （LLS，AP012281）、Lactococcus lactissubsp.cremorisSK11 （LLC，CP000425）、Lactococcus lactissubsp.cremorisMG1363（LLM，AM406671）、Lactococcus lactissubsp.cremorisA76（LLR，CP003132）、Lactococcus lactissubsp.cremorisNZ9000（LLN，CP002094）、Lactococcus lactissubsp.cremorisUC509.9（LLI，CP003157）。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌KLDS 4.0325的叶酸（VB11）生物合成途径分析

有两条关于叶酸合成的途径。其中，第一条合成途径由嘌呤代谢（purine metabolism）途径中所产生的GTP，即鸟嘌呤核苷三磷酸作为整个合成途径的最初底物，经一系列酶的催化形成叶酸；第二条途径是由苯基丙氨酸合成（phenylalanine biosynthesis）途径中形成的分支酸（chorismate）也可以进入叶酸合成途径叶酸。

乳酸乳球菌的叶酸生物合成途径中涉及的酶在各乳酸乳球菌中的分布如表1所示。在第一条叶酸合成途径中，KLDS4.0325、LLA、LLC和LLM 4株乳酸乳球菌除了不含[EC3.6.1.-]编码基因外，它们的基因组中包含有整个合成途径中其他酶类的编码基因。因此，这4株菌在发酵过程中可正常产生叶酸。而其他6株菌株因不含关键性GTP环化水解酶Ⅰ[EC3.5.4.16]，同时也不含另一途径中的关键性酶[EC3.6.1.-]和碱性磷酸酶[EC3.1.3.1]，因而不能通过该途径产生叶酸。在该途径中，KLDS4.0325和LLM的基因组中编码的整个叶酸合成途径的所涉及的酶的编码基因拷贝数完全相同，特别是碱性磷酸酶的编码基因拷贝数都为2，而菌株LLA和LLC所涉及的酶的编码基因均为单拷贝基因。另外，KLDS4.0325和LLM的基因组中都同时编码了二氢叶酸合成酶（dihydrofolate synthase）和叶酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase），而菌株LLA和LLC基因组中只编码了叶酸多聚谷氨酸合成酶。因此，在第一条叶酸合成途径中，KLDS4.0325和LLM在基因水平上表现出了较强的合成能力。

表1 叶酸生物合成途径中涉及的酶在10株乳酸乳球菌基因组中的分布Table 1 Distribution of enzymes involved in folate biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

此外，乳酸乳球菌KLDS4.0325和9株参考菌株还可以通过苯基丙氨酸合成途径中形成的分支酸（chorismate）进入叶酸合成途径生成叶酸。由表1可知，包括KLDS4.0325在内的10株乳酸乳球菌都含有该途径的完整编码基因。因此，这10株菌株都可以由该途径产生叶酸。但是，各菌株基因组中相关酶的编码基因的分布情况存在一定差异。例如，关于能够催化分支酸形成4-氨基-4-脱氧分支酸的帕拉-对氨基苯甲酸甲酯合成酶的编码基因，菌株KLDS4.0325、LLK、LLT、LLS、LLR以及LLN的基因组中该酶的编码基因拷贝数均为2，而其他菌株都为1。此外，关于二氢叶酸合成酶（ihydrofolate synthase）和叶酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase）的基因在各菌株基因组中的存在情况的差异也比较大，其中KLDS4.0325、LLK、LLM、LLR、LLN以及LLI的基因组中同时编码这两种基因，其他菌株只编码了叶酸多聚谷氨酸合成酶基因。

2.2 乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黄素生物合成途径分析

在核黄素（riboflavin）代谢通路中有两条核黄素的合成支路：第一条支路是来自于嘌呤代谢（purine metabolism）途径产生的鸟嘌呤核苷三磷酸腺苷（guanosine 5’-triphosphate，GTP）经过一系列酶的催化产生核黄素；另一条支路是由磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）产生的D-核酮糖5-磷酸经一系列酶催化产生核黄素。

表2 核黄素合成途径中相关酶在10株乳酸乳球菌中的分布Table 2 Distribusion of enzymes involved in riboflavin biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

由表2可知，10株菌株都不含有第一条支路中的关键酶的编码基因[EC3.1.3.-]。因此，10株菌株全都不能通过该支路完成核黄素的合成。在另一条核黄素合成支路中，10株菌的基因组中都含有编码该途径上的所有相关酶类的基因，且编码酶的基因个数完全相同，均为单拷贝基因。因此，10株菌都可以通过该途径进行VB2的生物合成，并且在基因水平上，乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黄素合成能力与这9株菌相比无明显差异。

2.3 乳酸乳球菌KLDS4.0325的其他B族维生素合成途径分析

表3 乳酸乳球菌KLDS4.0325在VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12的生物合成途径中缺失的关键酶Table 3 The key enzymes absent from biosynthetic pathways for VB1V,B3V,B5V,B6V,B7 andd VB1122 iinn L.lactiiss KLDS4..00332255

应用同样的方法对乳酸乳球菌KLDS4.0325进行其他常见B族维生素的代谢途径分析。如表3所示，该菌株基因组中缺乏编码VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12等生物合成途径关键酶的基因，因此不具备合成这些B族维生素的潜力。

3 结 论

对乳酸乳球菌KLDS4.0325的B族维生素生物合成途径进行生物信息学分析的结果表明，该菌株基因组中编码了较为完整的叶酸和核黄素合成途径的基因。与其他9株参考菌株相比，乳酸乳球菌KLDS4.0325在基因水平上表现出了较强的叶酸合成潜力，而核黄素合成能力与参考菌株差别不大。由于该菌株基因组中缺乏编码其他B族维生素合成的关键性酶基因。因此，在基因水平上表现出不能合成其他B族维生素的能力。叶酸是人类膳食中所必需的化合物，但是叶酸在个别群体中甚至较为发达国家的人群中是缺乏的，人体中缺乏叶酸可能会导致神经管缺陷病，冠心病和某些癌症的发生。因而，获得一系列具有高产叶酸能力的发酵剂是十分必要的。目前，基因工程技术发展速度较快，在后续的研究中，可以尝试应用基因工程的方法对该菌株的某些叶酸合成基因进行过度表达以获取更多的叶酸。

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