滁菊总黄酮的镇痛作用及与一氧化氮和前列腺素E2的关系

张蓓蓓，陈志武，罗胜勇，马 征

◇药学研究◇

滁菊总黄酮的镇痛作用及与一氧化氮和前列腺素E2的关系

张蓓蓓1，2，陈志武1，罗胜勇3，马 征3

目的研究滁菊总黄酮（TFCC）的镇痛作用及其可能机制。方法镇痛作用采用小鼠扭体法、温浴法、福尔马林法、热板法进行检测；血清和脑组织中一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）含量分别采用Griess法和紫外分光光度法测定。结果灌胃给药TFCC 100、200 mg/kg可明显减少小鼠扭体反应数，降低小鼠福尔马林致痛作用第Ⅱ时相疼痛反应评分值，延长小鼠热板舔足反应潜伏期和热水缩尾反应潜伏期；小鼠侧脑室给药TFCC 5、10 mg/kg可明显抑制小鼠扭体反应。灌胃给药TFCC 100、200 mg/kg可明显提高小鼠血清和脑组织中NO含量，但可降低PGE2含量。结论TFCC具有明显镇痛作用，其镇痛机制可能与促进NO释放和抑制PGE2生成有关。

滁菊总黄酮；镇痛；一氧化氮；前列腺素E2

滁菊为菊科多年生草本植物，产于安徽滁州，是菊花中花瓣最为紧密的一种，其药用价值名列全国四大药菊之首。滁菊性微寒、味辛、苦、甘，归肝肺经，具有疏风、清热、明目、解毒之功效［1］，主要治疗头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疔疮、肿毒等症。滁菊药用部分为其干燥头状花序，主要成分有黄酮类、挥发油类、氨基酸类和微量元素类等。文献［2］报道黄酮类化合物如金丝桃苷、槲皮素、芦丁等，有较强的镇痛作用。笔者推测滁菊总黄酮（total flavone of Chuzhou chrysanthemum，TFCC）可能也有一定的镇痛作用，因此，该研究采用多种镇痛模型对TFCC的镇痛作用及其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物昆明种小鼠，SPF级，18～22 g，雌雄各半（热板法用雌性小鼠），由安徽医科大学实验动物中心提供。动物分组分笼饲养于12 h明暗交替的环境中，温度为18～21℃，相对湿度为（50± 5）%，标准饲料喂养，自由摄食、饮水。

1.2 药品TFCC：由安徽医学科学研究院植物化学研究所从滁菊中提取，黄色粉末，总黄酮含量＞60%，使用前用生理盐水（NS）配制；吗啡（morphine，Mor）：沈阳第一制药厂，批号006283；阿司匹林（aspirin，Asp）：中国医药公司上海分公司，批号960120；一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号20120809。其他所用试剂均为国产AR级试剂。

1.3 方法

1.3.1 小鼠扭体法［3］昆明种小鼠随机分为6组：生理盐水组（NS）、阳性对照药Mor组（4 mg/kg）、Asp组（40 mg/kg）、TFCC（50、100和200 mg/kg）组，每组10只，雌雄各半。除Mor为腹腔内注射一次给药外，其他各组小鼠分别灌胃NS或受试药1次/d，连续5 d。Mor给药30 min时；其他受试药或NS末次给药60 min时，每只小鼠腹腔内注射0.6%冰醋酸0.2 ml，观察记录15 min内小鼠扭体总数。

1.3.2 小鼠温浴法［3］将小鼠放入特制鼠笼装置的固定筒内，尾尖浸入50℃恒温水浴中，侵入长度为3 cm，观察记录尾回缩出水面的潜伏期（tail-curling latencies，TCL），以TCL作为痛阈。预先筛选痛阈5～30 s者为合格鼠，给药前测痛2次，间隔5 min，取其平均值作为基础痛阈。小鼠分组及给药情况同1.3.1。

1.3.3 小鼠福尔马林法［3］小鼠右后足跖皮下注射2 mol/L福尔马林20 μl后，立即置于20 cm玻璃缸中，观察注射后0～10 min（第Ⅰ时相）和10～60 min（第Ⅱ时相）动物的行为反应。并对小鼠的痛反应进行疼痛分级（每次观察时间为3 min）：舔、咬或抖足3分；提足2分；轻触底面但不负重，行走时跛行1分；正常负重，走动自如0分。小鼠分组及给药情况同1.3.1。

1.3.4 小鼠热板法［4］将小鼠置智能恒温热板仪上（55.0±0.5）℃，以小鼠出现舔后足反应潜伏期为痛阈指标。实验前筛选痛阈5～30 s者为合格鼠，给药前测痛2次，间隔10 min，取其平均值作为基础痛阈。除各组均为雌性小鼠外，分组及给药情况同1.3.1，于末次给药后15、30、60、90 min各重复测定舔足潜伏期。

1.3.5 小鼠侧脑室法［5］小鼠随机分为生理盐水组（NS）、Mor对照组（0.2 mg/kg）、Asp对照组（2.0 mg/kg）及TFCC（5、10 mg/kg）组，每组10只，雌雄各半。在小鼠头部两耳线与矢状缝交点的左右前外各2 mm处进针，深度为2 mm，注射受试药10 μl。给药15 min后，按1.3.1方法测定小鼠扭体反应情况。

1.3.6 生化指标的测定［6］雌性小鼠随机分为5组，分别腹腔内注射NS、Mor 4.0 mg/kg及TFCC 50、100、200 mg/kg。60 min后置于（55.0±0.5）℃热板仪上测痛2次，然后摘取小鼠眼球取血，以3 500 r/min离心15 min制备血清，并快速取脑，称重后匀浆。将血清和脑匀浆液置－20℃冰箱保存待测生化指标。NO含量以Grieen法测定，按试剂盒提供方法操作后在550 nm处测定其吸收度；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）含量用紫外分光光度法测定，将PGE2在碱性液中脱水、异构化变为PGB1，在278 nm处测定其吸收度（A值）。

1.4 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件分析，实验数据以±s表示，两组数据比较用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 TFCC对小鼠扭体反应的影响与NS组比较，4 mg/kg Mor组可完全抑致小鼠扭体反应（P＜0.01）；与NS组比较，40 mg/kg Asp组，TFCC 100、200 mg/kg可明显减少小鼠扭体反应数（P＜0.01）。见表1。

表1 TFCC对小鼠扭体反应的影响（n＝10，±s）

表1 TFCC对小鼠扭体反应的影响（n＝10，±s）

与NS组比较：**P＜0.01

组别剂量（mg/kg）扭体数（次/15 min）抑制率（%）NS－25.2±4.2－Mor40**100.0 Asp4016.5±3.7**34.5 TFCC5022.8±4.69.5 10017.1±3.6**32.1 20013.8±5.5**45.2

2.2 TFCC对小鼠温浴法致小鼠缩尾反应的影响

与NS组比较，4 mg/kg Mor组、40 mg/kg Asp组、TFCC（100、200 mg/kg）组小鼠缩尾潜伏期明显延长（P＜0.01）。见表2。

表2 TFCC对小鼠温浴法致小鼠缩尾反应的影响（n＝10，±s）

表2 TFCC对小鼠温浴法致小鼠缩尾反应的影响（n＝10，±s）

与NS组比较：**P＜0.01

组别剂量（mg/kg）缩尾潜伏期（s）给药前给药后1 h NS－11.6±3.912.0±3.2 Mor412.6±3.050.4±8.4**Asp4012.9±3.420.4±5.4**TFCC5012.5±1.812.3±3.1 10012.7±3.016.0±3.2**20011.9±3.128.1±2.5**

2.3 TFCC对福尔马林诱发小鼠疼痛反应的影响

与NS组比较，腹腔内注射4 mg/kg Mor对福尔马林致小鼠疼痛Ⅰ相和Ⅱ相反应均有明显抑制作用（P＜0.01）；与NS组比较，40 mg/kg Asp组、TFCC（100、200 mg/kg）组对第Ⅰ时相（即5 min时）的疼痛反应无明显影响，但可显著降低第Ⅱ时相（即15 min时）的疼痛反应评分值（P＜0.01）。见表3。

表3 TFCC对福尔马林诱发小鼠疼痛反应的影响（n＝10，±s）

表3 TFCC对福尔马林诱发小鼠疼痛反应的影响（n＝10，±s）

与NS组比较：**P＜0.01

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2.4 TFCC对小鼠热板致痛反应的影响与NS组比较，4 mg/kg Mor可明显抑制小鼠热板反应，100、200 mg/kg TFCC灌胃给药可延长小鼠热板反应舔足潜伏期（P＜0.01，P＜0.05）。见图1。

2.5 侧脑室注射TFCC对小鼠扭体反应的影响侧脑室注射Mor 0.2 mg/kg可完全抑制腹腔内注射0.6%冰醋酸诱发的小鼠扭体反应，侧脑室注射5、10 mg/kg TFCC也可明显减少小鼠扭体反应数，但侧脑室注射Asp 2.0 mg/kg对小鼠扭体反应无明显影响。见表4。

2.6 TFCC对小鼠脑组织和血清NO、PGE2含量的影响与NS组比较，TFCC 200 mg/kg显著增加小鼠脑组织和血清中NO含量（P＜0.01），TFCC 100 mg/kg也可显著增高小鼠脑组织中NO含量（P＜0.05），见图2；与NS组比较，TFCC 100和200 mg/kg还可显著降低小鼠脑组织和血清中PGE2含量（P＜0.01），见图3。

图1 TFCC对小鼠热板致痛反应的影响（n＝10，±s）

图2 TFCC对小鼠脑组织和血清中NO含量的影响（n＝10，±s）

图3 TFCC对小鼠脑组织和血清中PGE2含量的影响（n＝10，±s）

表4 侧脑室注射TFCC对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响（n＝10，±s）

表4 侧脑室注射TFCC对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响（n＝10，±s）

与NS组比较：**P＜0.01

组别剂量（mg/kg）扭体数（次/15 min）抑制率（%）NS－24.8±6.3－Mor0.20**100.0 Asp2.020.2±3.318.5 TFCC516.6±3.5**33.1 1011.9±4.0**52.0

3 讨论

生物总黄酮是许多中草药的有效成分，具有降血糖、抗氧化、镇痛、抗炎、抗过敏、抗癌等多种重要的生物活性。研究［2，5］表明银杏、映山红中的总黄酮可以抑制由化学或热刺激诱导的实验动物疼痛反应。

扭体法实验是模拟腹腔炎症的一种慢性持续性病理性内脏痛实验模型，通过注射冰醋酸导致小鼠感染腹膜炎而产生疼痛表现［7－8］。小鼠醋酸扭体实验中，总黄酮能显著减少小鼠扭体次数且对于延迟扭体反应开始时间也有明显作用［9］。在本实验中，注射TFCC 100、200 mg/kg能显著抑制小鼠由内脏疼痛导致的扭体次数。温浴法实验结果也表明TFCC对小鼠疼痛反应有一定抑制作用，给药后TFCC 200 mg/kg组痛阈潜伏期长于NS组。福尔马林法致痛模型模拟的是急性组织损伤所致的持续性疼痛，此模型引起的疼痛与临床慢性疼痛具有较好的相似性，其特点是引起的疼痛分为两个时相，分别代表不同类型的疼痛［10］。小鼠右后足跖皮下注射福尔马林0～10 min为第Ⅰ相反应（早期相），10～60 min为第Ⅱ相反应（迟发相），Ⅰ相反应主要为直接刺激C纤维所致，Ⅱ相反应有炎症机制参与［3］。本实验结果表明TFCC可明显抑制小鼠Ⅱ相反应，表明TFCC对炎症介质所参与的疼痛反应有明显镇痛作用。

侧脑室注射药法是一种可用于确定药物是否具有中枢镇痛作用的常用方法，本实验结果显示，侧脑室注射TFCC为灌胃给药剂量的1/20（即5 mg/kg）时便可显著减少小鼠扭体反应数，提示TFCC对小鼠可能有中枢性镇痛作用。热板法是一种经典快痛实验模型，是筛选中枢镇痛药的有效方法［3］。本实验结果表明Asp在该模型没有明显的镇痛作用，但与Mor一样，TFCC可延长小鼠舔足潜伏期，提示TFCC在该模型上有镇痛作用，这与上述侧脑室注射给药也是一致的，即TFCC可能有中枢性镇痛作用。

NO是一种重要的信息传递物质和神经递质。近年来有关NO对疼痛的影响研究很多，争议也较多，已知NO在外周和中枢中以不同水平参与痛觉的调节。有研究［6］表明，脑组织中NO含量增高，可以提高机体的疼痛阈值，具有镇痛作用。本研究表明TFCC在抑制小鼠热板反应时能提高脑组织及血清中NO含量，提示TFCC镇痛作用可能与促进NO释放有关。PGE2是一种非常重要的疼痛介质之一，PGE2的外周致痛作用早已明确［10－11］。本研究表明，TFCC可降低脑组织和血清中的PGE2含量，提示TFCC的镇痛作用与抑制PGE2合成也有一定关系。

综上所述，TFCC具有明显镇痛作用，是一种具有很好开发前景的镇痛药物，其作用机制可能与促进脑组织和血清中NO释放，降低脑组织和血清中PGE2含量有关。

［1］ 中国药典编辑委员会.中国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：218－47.

［2］ 陈志武，方 明，马传庚.银杏叶总黄酮的镇痛作用研究［J］.安徽医科大学学报，1997，32（2）：15－6.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2005：1052－3.

［4］ 杨桂林，何 颖，袁叶飞，等.青果总黄酮的急性毒性及镇痛作用研究［J］.安徽农业科学，2012，40（5）：2674－5，2678.

［5］ 宋小平，陈志武，张建华，等.映山红总黄酮的镇痛作用［J］.安徽医科大学学报，2006，41（4）：427－9.

［6］ 宋小平，陈志武，张建华，等.映山红总黄酮的镇痛作用机制［J］.中药材，2007，30（2）：182－5.

［7］ 崔 珏，李 超，姜中生.桑白皮总黄酮的抗氧化与镇痛活性研究［J］.食品科学，2011，32（23）：281－4.

［8］ 孔劲松，杨兴海.皱皮木瓜总黄酮镇痛作用的机制分析［J］.时珍国医国药，2009，20（3）：549－50.

［9］ 杨 林，林 鹏，钱娇玲，等.棉团铁线莲镇痛抗炎有效部位研究［J］.中医药学报，2013，41（3）：23－7.

［10］张 波，王东风，王 爽.蜂胶总黄酮镇痛作用及其机制研究［J］.中国药房，2005，16（19）：1458－60.

［11］谭秦莉，刘 冬，李玉宝，等.总黄酮化合物药理作用研究进展［J］.安徽中医学院学报，2009，28（3）：62－4.

The relationship between analgesic effect of total flavonoids of Chuzhou chrysanthemum and nitric oxide and prostaglandin E2

Zhang Beibei1，2，Chen Zhiwu1，Luo Shengyong3，et al
（1Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Biochemistry，Chuzhou City Vocation College，Chuzhou 239000；3Institute of Pharmacology Toxicology，Anhui Academy of Medical Sciences，Hefei 230061）

ObjectiveTo study the analgesic effect of total flavone of Chuzhou chrysanthemum（TFCC）and its mechanism.MethodsWrithing test，warm bath method，formalin method，the hot plate test were used to examine analgesic effect on mice，and serum and brain tissue nitric oxide（NO）and prostaglandin E2（PGE2）contents were determinated the Griess method and ultraviolet spectrophotometry.ResultsIntragastrical administration of TFCC 100 mg/kg and 200 mg/kg could significantly reduce the writhing number in mice，II-phase pain in formaldehyde induced pain in mice，and prolonged the mice hot plate licking foot response latency and hot shrinkage tail reaction time.Intracerebroventricular injection TFCC 5 mg/kg and 10 mg/kg could significantly inhibit the writhing number in mice.TFCC 100 mg/kg and 200 mg/kg significantly increased mice serum and brain NO contents，and reduced PGE2contents.ConclusionTFCC has obvious analgesic effect，and its analgesic mechanism may be related to the promation of NO release and the inhibition of PGE2.

total flavonoids of Chuzhou chrysanthemum；analgesic；nitric oxide；prostaglandin E2

R 282.71；R 971.1

A

1000－1492（2014）03－0323－04

2013－09－17接收

国家自然科学基金（编号：81173596）

1安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032

2滁州城市职业学院生物化学教研室，滁州 239000

3安徽省医学科学研究院药理毒理研究所，合肥 230061

张蓓蓓，女，讲师，硕士研究生；陈志武，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：chpharmzw＠163.com