血小板黏附受体GPIb-IX-V介导的信号通路研究进展

胡 萍综述 谢如锋，王志成审校

血小板黏附受体GPIb-IX-V介导的信号通路研究进展

胡 萍1，2综述 谢如锋2，王志成3审校

血小板在生理性止血和病理性血栓形成中起关键作用。血小板黏附受体GPIb-IX-V复合物能与血管性血友病因子（VWF）、P-选择素、凝血酶等结合，在血小板血栓形成的起始阶段和凝血过程中起重要作用。磷脂酶C（PLC）、磷脂酶A2（PLA2）、14-3-3ζ蛋白、细胞骨架等参与GPIb-IX-V介导的信号通路，现就GPIb-IX-V复合物介导的信号通路作一综述。

血小板；糖蛋白；信号通路；血栓；止血

当血管内皮细胞受到损伤（如：动脉粥样硬化斑块破裂），或在病理性血流高剪切力作用下，血小板通过其表面糖蛋白（glycoprotein，GP）Ib-IX-V复合物中的GPIbα的膜外功能区，与血管内皮表面或血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）结合，这种结合使得血小板以滚动方式黏附在损伤血管表面［1］；同时，GPIbα与VWF结合启动血小板信号转导途径，血小板内发生Ca2＋浓度升高、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等蛋白激酶活化、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）释放等一系列反应，导致血小板表面另一受体整合素αIIb/β3的活化，活化的αIIb/β3与血浆中纤维蛋白原和VWF结合，最终导致血小板相互聚集成团，形成血小板血栓［1－2］。因此，GPIb-IX-V介导的信号通路在血小板血栓形成过程中起关键作用。

1 GPIb-IX-V结构

GPIb-IX-V复合物由4个跨膜亚单位组成：GPIbα通过二硫键与GPIbβ按1∶1比例形成GPIb，GPIb与GPIX以1∶1的比例通过非共价键组成GPIb-IX复合物。GPIb-IX复合物对于配体结合和信号转导是有效的。糖蛋白V（glycoprotein V，GPV）以1∶2的比例与GPIb-IX通过松散的方式构成GPIb-IX-V复合物［3］，见图1。

1.1 GPIbαGPIbα是GPIb-IX-V复合物中最大、也是最重要的1个亚基，由610个氨基酸残基组成，分子量为135 ku［3］。GPIbα基因定位在17号染色体短臂。GPIbα含有多个结构域，从N端开始：1－282，含有多个GPIb-IX-V配体的结合位点；283－302，由富含带负电荷氨基酸残基组成，包括天冬氨酸、谷氨酸以及3个硫酸化的酪氨酸残基；303－485，由高度糖基化、黏蛋白样的聚糖多肽构成；486－514为跨膜域；515－610为胞质尾［3］。GPIbα胞质尾含有细胞内蛋白或信号分子（例如：14-3-3ζ）结合位点。其中GPIbα 559、587/590、609位氨基酸残基为丝氨酸，磷酸化后能与信号蛋白14-3-3蛋白结合［4－5］。550－570位氨基酸残基含有肌动蛋白结合蛋白（actin binding protein，ABP）的结合位点，通过ABP将GPIb-IX-V复合物锚定在细胞膜骨架上，这种结合对于调节VWF诱导的血小板黏附和活化非常重要［6］。

1.2 GPIbβGPIbβ由181个氨基酸残基组成，分子量为25 ku。GPIbβ基因定位在22号染色体长臂。GPIbβ通过位于膜外附近的二硫键与GPIbα连接，通过15－32位氨基酸残基与GPIX非共价键相连［7］。胞质尾由34个氨基酸残基组成，含有钙调蛋白结合位点（149－167），其中166位是丝氨酸残基，能被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化，磷酸化丝氨酸能与14-3-3蛋白结合［1］。Maurer et al［8］使用抗GPIbβ胞外域的单克隆抗体RAM.1减少血小板黏附、GPIb介导的信号、凝血酶产生和动脉血栓形成，表明GPIbβ在GPIb介导的信号通路中起重要作用。

1.3 GPIXGPIX由160个氨基酸残基组成，分子量22 ku。GPIX基因定位在3号染色体长臂。胞质尾非常短，只有5个氨基酸残基组成，在细胞膜内侧附近含有1个被十六烷酰化的半胱氨酸残基，十六烷酰化修饰可能为锚定GPIb-IX-V到细胞膜提供另外一个机制［9］。

1.4 GPVGPV由544个氨基酸残基组成，分子量为82 ku。GPV基因定位在3号染色体长臂。GPV通过直接与GPIbα相互作用，连接2个GPIb-IX复合物。胞质尾由16个氨基酸残基组成，含有14-3-3蛋白和钙调蛋白结合位点［3］。在高剪切力条件下，GPV对于加强GPIb-IX-V复合物与VWF结合起关键作用［10］，见图1。

2 GPIb-IX-V介导的信号通路

VWF结合GPIb-IX-V能启动血小板内细胞转导途径，引起脱颗粒、胞内Ca2＋浓度增加、细胞骨架重排和“从内向外”活化整合素αIIb/β3，活化的αIIb/β3与VWF或纤维蛋白原结合，引起血小板聚集成团，形成血小板血栓［3］。GPIb-IX-V复合物介导的信号通路主要涉及以下几条通路，见图2。

图1 GPIb-IX-V结构示意图

图2 GPIb-IX-V介导的主要信号通路示意图

2.1 活化免疫受体酪氨酸基础的活化模序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITAM）含有的受体在理解VWF与GPIb-IX-V结合诱导的跨膜信号研究中，重大发现之一是发现两个ITAM含有的受体FcγRIIA和FcR-γ链酪氨酸残基的磷酸化。FcγRIIA是IgG低亲和力受体，分子量为40 ku的跨膜蛋白，其细胞外域含有两个IgG样结构域，细胞内域含有一个ITAM模序。聚集的免疫球蛋白能诱导FcγRIIA成簇并活化FcγRIIA，涉及肝素关联的血小板减少症［11］。FcR-γ链是Fc受体（如：FcεRI、FcγRI和FcγRIII）必需的1个亚基，也含有ITAM模序。在血小板中，FcR-γ链主要与GPVI连接构成胶原受体［12］。通常，当受体与配体结合后，ITAM模序内的2个酪氨酸残基发生磷酸化，通过与SH2域结合招募并活化Syk酪氨酸激酶，启动细胞内酪氨酸激酶基础的信号通路［13］。在完整的血小板中，VWF与GPIb-IX-V结合诱导快速的FcγRIIA酪氨酸磷酸化［13］。这个事件不是由血小板产生的血栓素A2（thromboxane A2，TxA2）介导，而是由Src激酶介导，因为Src激酶特异性抑制剂PP1能阻止这个过程［13］。使用荧光能量转移和酵母双杂交实验都证实GPIb-IX-V与FcγRIIA是相互结合在一起的［3］。GPIb-IX-V与FcγRIIA的结合发生在特异的脂筏区域［9］。VWF与GPIb-IX-V结合也能诱导Syk激酶介导的FcR-γ链酪氨酸磷酸化。VWF刺激诱导的FcR-γ链酪氨酸磷酸化是快速的、短暂的，最大在15～60 s，5 min内减少。PP1抑制剂能阻止FcR-γ链酪氨酸磷酸化以及与Syk的连接，表明这些事件是关联的，同时也证实Src家族在这个事件中起重要作用［14］。

2.2 Src家族酪氨酸激酶与GPIb-IX-V信号通路

通过研究钙离子动员和磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）研究发现，酪氨酸磷酸化信号事件涉及GPIb-IX-V介导的血小板活化。早在1994年，研究GPIb-IX-V介导的血小板活化时发现Src与细胞骨架连接，同时有多个蛋白酪氨酸磷酸化［15］。随后的研究［8］显示，VWF与GPIb-IX-V结合，能诱导酪氨酸激酶Syk和接头蛋白shc的酪氨酸残基磷酸化。Wu et al［14］使用VWF和botrocetin一起处理血小板，发现GPIb-IX-V介导的血小板活化能诱导FcR-γ链，Syk，LAT和PLCγ2的酪氨酸磷酸化。Src激酶抑制剂能显著地抑制上述蛋白的酪氨酸磷酸化事件，同时，VWF与GPIb-IX-V相互作用能诱导Src、Lyn、FcR-γ链和Syk形成复合物，表明Src激酶在这个过程中的重要作用［16］。VWF和瑞斯托霉素诱导的血小板活化，FcRIIA在Syk和PLCγ2活化之后也发生酪氨酸磷酸化，Src激酶抑制剂PP1能显著抑制这些事件［16］。在GPIb-IX-V介导的信号通路，Src是其最邻近的下游信号分子之一［16］。磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI-3K）激酶p85调节亚单位组成性与GPIb-IX-V结合，PI-3K抑制剂不影响该结合［3］。在VWF结合GPIb-IX-V诱导的血小板活化，Src通过其SH3域与连接在GPIb上的PI-3K的p85亚单位结合［16］。已证实Src激酶和它的下游信号分子PLCγ2参与许多血小板反应，包括在VWF包被的表面血小板Ca2＋动员和铺展［2］。最近Delaney et al［17］使用血小板Rac1-/-小鼠和Rac1抑制剂，发现Lyn-Vav-Rac1-PI3K-Akt信号通路在介导VWF/GPIb-IX引起的整合素αIIb/β3活化中起重要作用。

2.3 磷脂酶C（phospholipase C，PLC）与GPIb-IX-V信号通路许多研究已证实VWF结合GPIb-IX-V诱导PLC活化。Kroll et al［18］研究发现，用VWF和瑞斯托霉素处理血小板引起细胞内Ca2＋浓度升高和PKC介导的pleckstrin磷酸化，这两个事件都被PLC衍生的第二信使三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酯酰甘油（diacylglycerol，DAG）所调节。同时有研究［13］显示，这两个事件能被环氧化酶抑制剂indomethacin阻止，表明在GPIb-IX-V信号通路PLC活化位于磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）下游，需要TxA2的产生。TxA2结合血小板表面偶联有Gq蛋白的7次跨膜受体，活化PLCβ亚家族，主要是PLCβ2［19］。然而，由GPIb-IX-V介导的信号通路主要涉及PLCγ2而不是PLCβ2。PLCγ2活化受到酪氨酸磷酸化和PI-3K的脂质产物的调节［20］。已证实VWF与GPIb-IX-V结合能促进PLCγ2酪氨酸磷酸化，这个事件受到ITAM含有受体FcγRIIA和FcR-γ链的调节［13］。另外，抑制PI-3K可显著抑制GPIb-IX-V诱导的PLC活化［13］。

2.4 PLA2与GPIb-IX-V信号通路已有研究［13］证实，TxA2参与VWF诱导的血小板活化，特别是VWF诱导的PLC活化、Ca2＋动员、pleckstrin磷酸化和颗粒分泌，需要PLA2活化和随后TxA2的产生，所有这些事件能被阻止花生四烯酸转化为TxA2的环氧化酶抑制剂所阻断。但是，由VWF结合GPIb-IX-V复合物所引起的其他一些事件，如某些蛋白的酪氨酸磷酸化却不依赖TxA2的产生［13］。这些研究表明VWF结合GPIb-IX-V引起血小板活化通过TxA2依赖的和TxA2非依赖的信号通路。在VWF刺激血小板产生TxA2依赖的PLA2活化，主要是85 ku的胞质PLA2（cPLA2）［2］。胞质内Ca2＋浓度升高和丝氨酸残基磷酸化都能活化cPLA2。在VWF与GPIb-IX-V结合诱导的cPLA2活化，可能主要是通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）介导的505位丝氨酸残基磷酸化［8］。最近Estevez et al［21］使用LIMK-/-小鼠研究发现，LIMK-/-的血小板选择性损伤VWF/GPIb-IX诱导的cPLA2的磷酸化和随后的TxA2产生，提示LIMK1在GPIb-IX介导的TxA2合成和血栓形成中起重要作用。

2.5 14-3-3ζ与GPIb-IX-V信号通路14-3-3蛋白家族是细胞内接头蛋白，由异二聚体或同二聚体组成，含有两个配体结合位点，广泛参与细胞内信号转导［3］。人的血小板有5个14-3-3亚型，ε和η亚型弱表达，γ、ζ和β亚型高表达［22］。最初在纯化GPIb-IX-V时首次发现14-3-3ζ与GPIb-IX-V结合，随后的研究［23］发现GPIbα C端最后5个氨基酸残基（605-610）SGHpSL610包含609磷酸化丝氨酸对于14-3-3ζ与GPIb-IX结合非常重要，删除或封闭C端14-3-3ζ结合位点引起14-3-3ζ与GPIb-IX分离，同时抑制VWF与GPIb-IX的结合［23－24］。GPIb-IX第2个14-3-3ζ结合位点位于GPIbβ胞质域，其中166丝氨酸残基对于结合14-3-3ζ非常关键［3］。在静息血小板609位丝氨酸残基组成性磷酸化［23］，而166位丝氨酸残基磷酸化受到PKA的动态调节［25］。PKA通过磷酸化166位丝氨酸残基负性调节VWF与GPIb-IX的结合［33］。另外，Mangin et al［5］研究发现在GPIbα 580-590位氨基酸序列也能结合14-3-3ζ，其中587和590位丝氨酸的磷酸化在与14-3-3ζ结合中非常关键，该结合位点在调节整合素依赖的血小板铺展具有重要作用。Yuan et al［4］发现，在GPIbα 551－564位氨基酸序列也能结合14-3-3ζ，其中559位丝氨酸残基磷酸化非常关键。

2.6 GPIb-IX-V与细胞骨架血小板骨架组成收缩装置调节血小板形状改变和铺展，而且，细胞骨架参与形成细胞内信号网络，能连接和组装许多信号分子。许多研究已证实，配体与GPIb-IX-V结合能诱导细胞骨架重排，几个信号蛋白重新分布到新形成的肌动蛋白网络［1］。而且，有证据［3］表明，细胞骨架参与调节配体与GPIb-IX-V的结合。在高剪切力作用下，GPIb与VWF相互作用刺激纤维状肌动蛋白组装到GPIb-IX-V复合物［26］。VWF与GPIb-IX-V相互作用能诱导形成由细丝蛋白、肌动蛋白和GPIb-IX-V构成的复合物［8］。Feng et al［6］发现，ABP结合到GPIbα对于细胞骨架重排、血小板聚集和一些信号蛋白酪氨酸磷酸化是必需的。通过肌动蛋白结合蛋白将GPIbα结合到细胞膜骨架可能负性调节VWF与GPIbα的结合［27］。

2.7 PI-3K与GPIb-IX-V信号通路PI-3K的调节亚单位p85与GPIb-IX-V复合物结合，能介导Src结合到GPIb［16］。血小板黏附到固定的VWF能诱导PI-3K活化，或在瑞斯托霉素诱导下，可溶性VWF和GPIb-IX-V结合也能诱导PI-3K活化［3］。在高剪切力条件下，PI-3K与酪氨酸激酶Syk连接，而且，已证实在VWF刺激的血小板，PI-3K通过p85调节亚单位与GPIb-IX-V和Src形成复合物［16］。PI-3K活性状态不影响PI-3K与Src结合形成复合物，因为特异性PI-3K抑制剂wortmammin不抑制复合物的形成［16］。有研究［28］显示，GPIb-IX-V介导的Src和PLCγ2活化以及Ca2＋升高不受PI-3K活性的影响，但血小板聚集和铺展在VWF表面则依赖PI-3K的活性。但是，PI-3K在通过GPIb-IX-V引起血小板活化中的具体作用目前还不是很清楚。

2.8 环鸟苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）依赖的蛋白激酶之前通常被接受的观点是提高血小板胞质内cGMP浓度和cGMP依赖的蛋白激酶（protein kinase G，PKG）活性抑制血小板活化［29］。然而，最近的研究［30］表明，cGMPPKG信号通路在GPIb-IX-V介导的血小板活化中扮演重要的刺激作用。在细胞模型中，表达重组PKG提高VWF诱导的整合素αIIb/β3活化。

3 结语

GPIb-IX-V是血小板表面含量多的膜蛋白之一，在血小板血栓形成的起始和凝血过程中起关键作用。虽然GPIb-IX-V相关联的信号通路还没有完全阐明，但是越来越多的证据表明Src家族激酶和PLCγ2相关联的信号在GPIb-IX-V介导的血小板活化过程中发挥重要作用。在高剪切力条件下，GPIb-IX-V与整合素αIIb/β3之间对话对于血小板血栓形成起重要作用，但该对话所涉及的机制还需要深入研究。

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R 558；R 331.1＋43；R 34

A

1000－1492（2014）03－0419－05

2013－07－08接收

上海市教委科技创新项目（编号：12YZ068）；上海市自然科学基金（编号：12ZR1429900）

1华东师范大学生命科学学院，上海 200241

2上海市血液中心血液工程研究室，上海 200051

3上海市中医医院实验中心，上海 200071

胡 萍，女，硕士研究生；谢如锋，女，主任技师，责任作者，E-mail：rufeng33＠hotmail.com；王志成，男，助理研究员，责任作者，E-mail：ahwzc＠126.com