高压氧预处理诱导血红素加氧酶—1减轻大鼠脑出血后脑水肿

施振华 裘五四 王卫民 姜启周 秦智勇

【摘要】目的 研究血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）在高压氧预处理（hypeRbaic oxygen pReconditioning， HBOP）减轻大鼠脑出血后脑水肿形成过程中的作用。方法 本实验共选用54只雄性SpRadgue-Dawley大鼠，体质量300～350 g，分为两部分：第1部分，6只大鼠随机（随机数字法）分为两组（n=3），分别接受高压氧预处理（HBOP组）或假预处理（假预处理组）；预处理结束24 h后处死，取基底节组织，采用WesteRn blot法检测HO-1蛋白含量。第2部分：48只SD大鼠随机（随机数字法）分为四组（n=12），各组大鼠在预处理前腹腔内置入含HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ（zinc pRotopoRphyRin Ⅸ， ZnPPⅨ）的缓泵（0，01 mg/kg）（HBOP+ZnPP组、假预处理+ZnPP组）或含2 mL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）载体溶剂的缓释泵作为对照（HBOP+DMSO组、假预处理+DMSO组），随后接受高压氧预处理（HBOP组+ZnPP组，HBOP+DMSO组）或假预处理（假预处理+ZnPP组，假预处理+DMSO组）。预处理结束24 h后，立体定向基底节内注射自体股动脉血100 μL建立基底节脑出血模型，72 h后处死，采用干湿质量法测定脑组织水含量。统计学分析采用Stata 7，0软件进行成组设计资料的t检验。结果 HBOP组大鼠基底节组织内HO-1蛋白含量与假预处理相比差异具有统计学意义（P<0，05）；HBOP+DMSO组大鼠血肿同侧基底节组织水含量为（81，4±0，9）%，显著低于假预处理+DMSO组（82，6±0，8）%（P<0，05），但大鼠接受高压氧预处理同时腹腔内给予HO-1抑制剂ZnPPⅨ则抵消了HBOP减轻脑出血后脑水肿的效应[（82，8±0，9）% vs.（82，6±0，7）% （P>0，05）]。 结论 高压氧预处理显著减轻大鼠脑出血后脑水肿，其作用机制与其上调HO-1蛋白的表达有关。

【关键词】高压氧；预处理；大鼠；脑出血；脑水肿；血红素加氧酶-1；锌原卟啉Ⅸ

Hemeoxgenase-1 mediates the pRotective effect of hypeRbaRic oxygen pReconditioning against the bRain edema afteR expeRimental hemoRRhage in Rats Shi Zhenhua，Qiu Wusi，Wang Weimin，Jiang Qizhou，Qin Zhiyong. DepaRtment of NeuRosuRgeRy，The Affiliated Hospital of Hangzhou NoRmal UniveRsity，Hangzhou 310015，China

CoRResponding authoR： Qin Zhiyong， Email： wisdomqin@vip，163，com

【AbstRact】Objective To investigate the Role of Heme oxygenase-1 in the effect of hypeRbaRic oxygen pReconditioning （HBOP） against the bRain edema foRmation afteR expeRimental intRaceRebRal hemoRRhage in Rats.Methods The study was caRRied out by animal expeRiment in two steps by using 54 SpRadgue-Dawley Rats weighting fRom 300-350 g. In the fiRst step， Rats weRe tReated with HBOP （HBOP gRoup， n=3） oR with sham pRe-conditioning （Sham pRe-conditioning gRoup， n=3）. All the Rats weRe sacRificed 24 h afteR the pRe-conditioning， and basal ganglion of bRain tissue was taken foR detect HO-1 level by using westeRn blot analysis. In the second step， Rats weRe divided into 4 gRoups （n=12 in each gRoup）： HBOP+ZnPP gRoup， in which Rats had a micRo-pump intRa-peRitoneally implanted containing a specific HO-1 inhibitoR ZnPPⅨ（Zinc pRotopoRphyRin IX， 0，01 mg/kg）， Sham pRe-conditioning+Znpp gRoup， HBOP+DMSO gRoup， in which Rats with a intRa-peRitoneal micRo-pump containing 2 mL Dimethyl sulfoxide （DMSO， a solvent vehicle） and Sham pRe-conditioning+DMSO gRoup befoRe HBOP. At 24 houRs afteR the pRe-conditioning， Rats Received an infusion of 100 μL autologous blood into the caudate nucleus to foRm a simulated intRa-ceRebRum hemoRRhage （ICH）， and weRe sacRificed 72 h lateR foR bRain wateR content measuRements. All data weRe analyzed by using Stata 7，0 softwaRe and statistical analyses weRe caRRied out by two-tailed Student t test.Results CompaRed with the Sham pRe-conditioning gRoup， the HBOP gRoup had significant higheR level of HO-1. CompaRed with the Sham pRe-conditioning+DMSO gRoup， the HBOP+DMSO gRoup had a significant loweR level of wateR content in the ipsilateRal basal ganglion[（81，4±0，9）% vs. （82，6±0，8）% （P<0，05）]， howeveR， peRitoneal infusion of ZnPPⅨ befoRe HBOP abolished HBOP-induced pRotection against bRain edema foRmation afteR expeRimental ICH[（82，8±0，9）% vs.（82，6±0，7）% （P>0，05）]. Conclusions HypeRbaRic oxygen pReconditioning attenuate bRain edema foRmation afteR expeRimental ICH in Rats， and this pRotection is attRibuted to the activation of HO-1.

【Key woRds】HypeRbaRic oxygen；PReconditioning；Rat；IntRaceRebRal hemoRRhage；BRain edema；Heme oxygenase-1；Zinc pRotopoRphyRin

脑出血（intRaceRebRal hemoRRhage， ICH）后脑水肿程度是判断脑出血患者临床预后的重要因素，目前临床上对脑出血后脑水肿的治疗方法有限。Qin等[1]研究首次发现并报道高压氧预处理（hypeRbaRic oxygen pReconditioning， HBOP）显著减轻SD大鼠ICH 24 h后脑水肿。笔者前期实验研究显示，HBOP显著减轻大鼠ICH 72 h后脑水肿，减轻了血肿周围炎症反应并延缓了神经细胞凋亡[2]。 血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是体内催化血红素分解的限速酶，是一种应激蛋白（热休克蛋白32）[3]。HO-1在ICH后脑水肿发生发展过程中发挥重要作用，ICH后迅速上调表达[4]，HO-1特异性抑制剂能显著减轻实验动物ICH后及脑内注射血红蛋白降解产物后的脑水肿[5-7]。研究表明，HO-1的上调在HBOP以及缺血后处理诱导缺血-再灌注损伤耐受现象中起着重要的保护性作用[8，9]。HO-1是否也参与了HBOP诱导的ICH后脑保护性作用机制尚不明确，因此本实验通过观察HBOP对大鼠基底节组织内HO-1蛋白表达的影响以及HO-1特异性抑制剂锌原卟啉Ⅸ（zinc pRotopoRphyRin，ZnPPⅨ）对HBOP诱导的ICH后减轻脑水肿效应的影响，从而探讨HO-1在HBOP减轻大鼠脑出血后脑水肿过程中的作用，旨在进一步研究HBOP对大鼠ICH后脑保护效应的机制。

1 材料与方法

1，1 动物及分组

本实验选用雄性SpRadgue-Dawley大鼠共54只，体质量300～350 g，由复旦大学实验动物科学部提供。实验分为两部分，第1部分：6只大鼠随机（随机数字法）分为两组（n=3），分别接受高压氧预处理（HBOP组）或假预处理（假预处理组）。预处理结束24 h后，断头取基底节脑组织，采用WesteRn blot法检测HO-1蛋白的含量。第2部分：48只实验大鼠随机（随机数字法）分为四组（n=12），大鼠在预处理前腹腔内置入含HO-1抑制剂ZnPPⅨ的缓释泵（HBOP+ZnPP组、假预处理+ZnPP组）或含2 mL DMSO载体溶剂缓释泵作为对照（HBOP+DMSO组、假预处理+DMSO组），随后大鼠接受高压氧预处理（HBOP+ZnPP组、HBOP+DMSO组）或假预处理（假预处理+ZnPP组、假预处理+DMSO组）；预处理结束24 h后，基底节内注射自体股动脉血100 μL建立脑出血模型，脑出血72 h后断头取脑，采用干湿质量法测定脑组织水含量。

1，2 高压氧预处理与假预处理方案

大鼠HBOP和假预处理方案按Qin等[1，10]研究所采用的方案。HBOP：3 个绝对大气压（1个绝对大气压≈100 kPa），100% O2，每次1 h，1次/d ，连续5 d；假预处理：1个绝对大气压，空气， 每次1 h，1次/d ，连续5 d。本实验中具体方法为：HBOP组、HBOP+ZnPP组、HBOP+DMSO组大鼠置入动物实验用高压氧舱（DWC150/300型，中国上海七零一所杨园高压氧舱有限公司）内，以医用纯氧作气源，15 min内匀速加压至3个绝对大气压。通过调整进出口气流量维持氧舱内压力平稳，并维持舱内氧体积分数99%以上，持续1 h后于30 min内均匀降压至1个绝对大气压。每天1次，连续5 d。假预处理组、假预处理+ZnPP组、假预处理+DMSO组大鼠也置入高压氧舱内，只暴露于空气中，1 次/d，每天1 h，连续5 d。

1，3 大鼠脑组织内HO-1蛋白的WesteRn blot检测

HBOP组大鼠与假预处理组大鼠第5次预处理结束24 h后，腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）（国药集团化学试剂有限公司，中国上海）深度麻醉后，经左心室内灌注4 ℃的0，1 mmol/L PBS 直至右心室流出无色液体止。断头取脑，于穿刺点前后作一冠状位断层，将大鼠基底节组织样本浸没于0，5 mL WesteRn blot样本缓冲液（62，5 mmol/L TRis-HCl，pH 6，8，2，3% SDS，10% 甘油，5%β-巯基乙醇），超声乳化后备用。从各组样本中取出蛋白含量为50 mg的样本置于95 ℃下水浴煮5 min变性后，将样本置于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后将凝胶转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜在脱脂奶粉中封闭后，一抗以兔抗鼠HO-1抗体（1∶ 2000稀释，Cell Signaling Technology）孵育过夜，随后二抗以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig-G抗体（Bio-Rad laboRatoRy ，USA）孵育。抗原抗体复合物通过ECL发光体系统检测（AmeRsham），最终曝光于光感胶片（X-OMAT， Kodak），蛋白条带的相对浓度采用NIH Image 软件（ 版本：1，62，NIH）图像分析软件处理。

1，4 HO-1抑制剂ZnPPⅨ缓释泵及载体溶剂DMSO液缓释泵腹腔内置入

HBOP+ZnPP组及假预处理+ZnPP组大鼠在接受预处理前腹腔内置入含ZnPPⅨ（0，01 mg/kg）（Sigma公司，美国）的缓释泵。HBOP+DMSO组及假预处理+DMSO组大鼠则在接受预处理前腹腔内置入含 2 mL DMSO载体溶剂（Sigma公司，美国）缓释泵作为对照。微泵持续5 d与预处理持续时间相同。

1，5 大鼠基底节脑出血模型的建立

大鼠脑出血模型采用较成熟的基底节自体股动脉血注射法，如文献[3，10-11]所述的方法。本实验具体方法为：HBOP+ZnPP组、假预处理+ZnPP组、HBOP+DMSO组、假预处理+DMSO组大鼠在第5次HBOP或假预处理结束24 h后，1%戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，上海，中国）腹腔注射麻醉（45 mg/kg），头部及股部备皮，安尔碘消毒，头部固定于小动物立体定向仪（ALC-H型，上海奥尔科特生物技术有限公司，中国上海）上，切开右股部皮肤，显微分离暴露股动脉，置入24 G静脉留置针以备取血。应用动物实验用恒温系统（ALC-HTP型，上海奥尔科特生物技术有限公司生产，中国上海）控制肛门温度为37～37，5 ℃。头部正中切开暴露冠状缝及中线矢状缝，在右侧冠状缝上距中线旁开3，5 mm处，颅骨钻孔直径约1 mm。用1 mL注射器取自体股动脉血，连接26 G注射用针头，自颅骨钻孔处垂直进针，自硬脑膜起深度为5，5 mm，在10 min内匀速向大鼠基底节内推注100 μL自体股动脉血，留针5 min后缓慢退针。骨腊封闭颅骨孔，丝线缝合皮肤。在基底节注入血肿前监测动脉血pH、PaO2、PaCO₂、血球压积、血糖。

1，6 大鼠脑组织水含量测定

脑出血模型制作72 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，中国上海）深麻醉（60 mg/kg），快速断头完整取出脑组织，以皮层穿刺点为中心作一冠状位断层（层厚约3 mm），该断层脑组织再沿中线分离为右侧皮层、右侧基底节、左侧皮层、左侧基底节，另取小脑作为参照。迅速用电子分析天平（AL-104-IC型，METTLER TOLEDO，中国上海）分别称取湿质量（精确到0，1 mg），然后置入100 ℃恒温干燥箱（DHG-9023型 国药集团上海医疗器械有限公司，中国上海）烘干24 h，取出后迅速分别称量干质量。通过干湿称重法计算各脑组织标本含水量，计算公式为：脑水含量= [ （湿质量-干质量） /湿质量] ×100%。

1，7 统计学方法

采用Stata 7，0统计软件进行，脑组织水含量数据及HO-1蛋白条带像素值数据采用均数±标准差（x±s）表示，多组间的均数比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，对比采用成组设计资料的t检验，以P<0，05为差异具有统计学意义。

2 结果

2，1 生理学参数

本实验中大鼠基底节注射自体动脉血时各项生理学参数：动脉血pH、PaO2、PaCO₂、血糖值、血球压积均大致在正常范围（表1）。

2，2 大鼠基底节组织内HO-1蛋白含量

WesteRn blot检测结果显示，HBOP组大鼠基底节内HO-1蛋白含量显著高于假预处理组。HBOP组大鼠HO-1蛋白条带为（2590±724）像素，是假预处理组（834±549）像素的3倍（P<0，05），实验结果表明，HBOP显著上调了大鼠基底节组织内HO-1蛋白表达（图1）。

2，3 脑组织水含量

HBOP+ZnPP组及假预处理+ZnPP组大鼠血肿同侧基底节组织水含量分别为（82，8±0，9）%，（82，6±0，7）%，组间对比差异无统计学意义，HBOP+DMSO组大鼠右侧（血肿侧）基底节组织水含量为（81，4±0，9）%显著低于假预处理+DMSO组（82，6±0，8）%（P<0，05）（表2）。实验结果表明，HBOP显著减轻了大鼠ICH后脑水肿，而在预处理同时腹腔内给与HO-1抑制剂ZnPPⅨ抵消了HBOP诱导的减轻脑出血后脑水肿的效应。

3 讨论

血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是催化血红素降解为铁离子、一氧化碳、胆绿素的限速酶，是一种应激蛋白[12]，在发热、氧化应激、缺氧与脑缺血及脑出血等应激状态下，可在脑内被大量诱导、表达合成。研究表明，HO-1的上调表达对机体起着抗炎、抗氧化应激、减轻细胞凋亡等多种细胞保护作用[13]，且在各种预处理方式诱导的缺血-再灌注损伤耐受现象中起着重要作用[8-9，14-15]。

本实验研究显示，HBOP组大鼠基底节组织内HO-1蛋白含量显著高于假预处理组， HBOP显著上调了大鼠基底节组织内HO-1的含量。实验中HBOP+DMSO组大鼠血肿同侧基底节组织内脑组织水含量显著低于假预处理组+DMSO组，而HBOP+ZnPP组大鼠血肿同侧基底节组织内脑组织水含量与假预处理+ZnPP组大鼠差异无统计学意义。这表明大鼠在接受HBOP同时腹腔内应用HO-1特异性抑制剂泵ZnPPⅨ抵消了由HBOP诱导的减轻ICH后脑水肿的效应。因此，笔者认为，HO-1的上调是HBOP减轻大鼠脑出血后脑水肿的重要机制，HBOP通过诱导HO-1蛋白的上调表达起到了减轻大鼠脑出血后脑水肿的作用，体现出了一种保护性的效应。

本实验并未观察HBOP对大鼠ICH后HO-1蛋白表达的影响。HO-1在ICH后脑水肿产生过程中所起的作用比较复杂，ICH后脑水肿产生的主要机制为血红蛋白及其降解产物的毒性作用[3，16-18]，HO-1可被血红素本身迅速地上调表达[19]。宫晔[7]在大鼠ICH后腹腔内置入HO-1抑制剂ZnPP微泵显著减轻了大鼠ICH后脑水肿。Huang等[5]研究发现，随着大鼠脑内血红蛋白的增加可使HO-1水平上调，脑内应用另一种HO-1抑制剂—锡原卟啉（SnPP）显著减轻了大鼠基底节内注射血红蛋白引起的脑水肿，由此认为HO-1水平的上调可以增加脑内血红素的降解，从而加重ICH后的脑损伤。这些又提示在ICH后HO-1的上调表达加重了ICH后的脑水肿，并产生损害性的作用。笔者前期的预实验结果也同样发现，高压氧预处理或假预处理后大鼠在ICH后基底节内HO-1蛋白表达含量均显著上调，但两者差异并无统计学意义。笔者认为，这与HO-1蛋白在ICH后可被血红素本身显著性的大幅度上调相关。本研究提示HBOP通过上调HO-1的表达起到对大鼠ICH后的保护性作用，这可能是因为HO-1在ICH前被HBOP低幅度的上调表达从而抑制了ICH后HO-1被血红素显著上调时所产生的损害性效应，但是其具体机制仍未完全阐明。HBOP通过何种分子生物学机制诱导上调HO-1蛋白的表达，以及HO-1如何通过受到多重影响因素调控而对脑出血后脑水肿结局的发生发展的结局起到不同影响的作用机制目前尚不明了，这些都有待于进一步深入研究。高压氧预处理方式相比于其他预处理方式更为安全有效，值得我们进一步研究探索。

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（收稿日期：2013-05-13）

（本文编辑：邵菊芳）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，010

基金项目：国家自然科学基金（30672153）

作者单位：310015 杭州，杭州师范大学附属医院神经外科（施振华、裘五四、王卫民、姜启周）；复旦大学附属华山医院神经外科（秦智勇）

通信作者：秦智勇，Email： wisdomqin@vip，163，com

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