大鼠血浆中10-羟基喜树碱含量测定方法

李思阳

（江苏食品药品职业技术学院 医药与健康管理系，江苏 淮安 223003）

大鼠血浆中10-羟基喜树碱含量测定方法

李思阳

（江苏食品药品职业技术学院 医药与健康管理系，江苏 淮安 223003）

实验旨在建立大鼠血浆中10-羟基喜树碱含量的测定方法。通过高效液相色谱荧光检测HCPT和CPT的含量，建立了大鼠血浆中HCPT的浓度（X）与HCPT的峰面积和CPT的峰面积之比（Y）的线性回归方程以及回归系数。HCPT和CPT均可与血浆中的其他成分较好地分离，血药浓度在6.25～400 ng·mL－1范围内呈良好的线性关系，回归系数为0.9988。这种方法重现性好，操作简便，适用于血浓度检测。

羟基喜树碱；喜树碱；高效液相色谱；血浆

喜树碱（camptothecin，CPT）是1966年由Wall等［1，2］从我国特有的珙桐科植物喜树Camptotheca acuminata Decne中分离得到的一种吲哚类生物碱，具有显著的广谱抗肿瘤活性［3，4］。10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）作为喜树碱的天然衍生物，是我国临床应用的喜树碱类抗肿瘤药物。目前已经有文献［5－8］报道检测血浆中HCPT含量的高效液相色谱法，但一般使用紫外检测器并采用外标法定量，灵敏度和准确度较低。本研究使用荧光检测器，以CPT为内标，以乙醚为萃取溶剂制备样品，尝试一种选择性好、灵敏度高的测定大鼠血浆中HCPT浓度的高效液相色谱法，为进一步研究HCPT的药代动力学提供实验依据。

1 实验材料

1.1 试剂

CPT、HCPT：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯，购于哈尔滨峰源高科技开发有限公司。

1.2 动物

洁净级大鼠，体重200 g左右，购于吉林大学实验动物中心。

1.3 仪器

高效液相色谱系统，包括1525型二元泵、717型自动进样器、2475型荧光检测器：美国Waters公司；Sorvall Legend Micro17型离心机：美国Thermo公司；H-H-2数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；WH-986静音混合器和WH-861漩涡混合器：江苏省太仓市科教器材厂。

2 实验方法

2.1 血浆样品的采集

从大鼠心脏取血，置于2 mL肝素化试管，4000 r·min－1离心30 min，取上清液，－80℃冷冻保存。

2.2 溶液的制备

精密称取HCPT、CPT各1 mg，分别用甲醇溶解，定容至25 mL，得到浓度为40μg·mL－1贮备液，分装，－80℃冰箱保存备用。实验时，用甲醇将HCPT贮备液稀释成浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng·mL－1的系列标准溶液，用甲醇将CPT贮备液稀释成浓度为200 ng·mL－1的溶液作为内标溶液，－80℃冰箱保存备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.2 mL·min－1；荧光检测器检测；激发波长：383 nm；发射波长：553 nm；流动相：水（A）-甲醇（B），采用梯度洗脱。

2.4 系统适用性实验

取甲醇、空白血浆＋HCPT＋内标，按“2.3”项

中色谱条件进样分析，检测内标物质与待测组分的分离度。

2.5 标准曲线的建立

取空白血浆100μL，依次加入内标溶液、HCPT系列标准溶液和1％冰乙酸各100μL，再加入乙醚约700μL，将混合液涡旋1 min、静音混合60 min后，13000 r·min－1离心20 min，取上清液重复萃取1次，合并上清液置于干净的离心管中，40℃水浴，空气流吹干，最后用甲醇200μL溶解，12000 r·min－1离心5 min，取上清液50μL进样。以HCPT标准溶液浓度（c）为横坐标，HCPT峰与CPT峰面积之比（A）为纵坐标制备标准曲线，采用加权最小二乘法进行回归分析。

2.6 方法回收率与精密度实验

按“2.2”项中方法制备低、中、高浓度的HCPT质控样品溶液，按“2.5”项中方法处理后进样，每天连续测定6次；每天对低、中、高浓度的溶液各测定1次，连续测定6 d，随行标准曲线，计算方法回收率及日内、日间精密度。

3 实验结果

3.1 色谱条件的确定

经过对高效液相色谱条件的摸索，确定了梯度洗脱条件，详见表1。

表1 梯度洗脱条件

3.2 系统适用性实验

分别将色谱级甲醇、以CPT为内标物的HCPT注入高效液相色谱，来检测溶剂对本实验是否有干扰以及CPT和HCPT的分离程度。其色谱图分别见图1、图2。

图1 甲醇的空白色谱图

图2 以CPT为内标物的HCPT在血浆中的色谱图

从图1和图2可以看出，甲醇试剂并没有对CPT和HPCT的分离产生影响，此外，在“2.3”项中，CPT与HCPT能够有效地分离，峰形良好，其保留时间分别为11.34 min和10.58 min。

3.3 标准曲线的绘制

由图3可知，HCPT浓度在6.25～400 ng/mL－1时线形关系良好，实验方法操作简单，方便易行，稳定性好，适用于血药浓度研究。

3.4 方法回收率与精密度实验

由表2结果可知，实验方法回收率较高，相对误差小，相对校准偏差较小，证明实验方法准确、可靠。

图3 HCPT系列浓度标准曲线

表2 方法回收率与精密度实验结果（n＝6）

4 结论

CPT和HCPT均为水不溶性物质，但化学结构中E环闭合的内酯结构在碱性条件下可开环形成可溶于水的羧酸盐形式，因此在分析样品中加入1％乙酸，以保证其E环内酯结构处于闭合状态。

比较了不同梯度洗脱和等度洗脱条件对实验的影响，结果表明，梯度洗脱峰形优于等度洗脱，在选定的梯度洗脱条件下HCPT和内标与杂质均可实现良好分离，并可去除色谱柱中残留的脂溶性杂质，提高色谱柱的使用寿命。此外，使用甲醇与水混合作流动相既降低了成本又减少了试剂的毒性，达到了预期的实验效果。

使用不同的有机溶剂萃取样品，经过比较发现，乙醚的萃取效果相对较好，故本实验采用乙醚作为有机溶剂对样品进行处理，制备样品。

本实验主要探索大鼠血浆中HCPT含量的测定方法，这种方法简单有效，能够实现CPT和HCPT的良好分离，这些结果可为以后更好地研究HCPT在大鼠体内的药代动力学提供理论依据。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，etal.Plant Antitumor Agents.I.The Isolation and Structure of Camptothecin，a Novel Alkaloidal Leukemia and Tumor Inhibitor from Camptotheca Acuminata［J］.J Am Chem Soc，1966，88（16）：3888－3890.

［2］黄瑞松，叶云锋，梁启成，等.HPLC法测定不同产地喜树果中喜树碱［J］.中草药，2009，40（1）：137－140.

［3］Hsiang Y H，Hertzberg R，Hecht S，etal.Camptothecin Induces Protein-linked DNA Breaks Via Mammalian DNA Topoisomerase I［J］.J Biol Chem，1985，260（27）：14873－14878.

［4］谢峻，谈锋.植物来源抗肿瘤药物研究进展［J］.中草药，2007，38（2）：285－289.

［5］吴映蓉，张灿珍.测定小鼠血浆及组织中羟基喜树碱浓度的研究［J］.中国药业，2002，11（9）：30－32.

［6］杨元勋，张晶晶，李庆平.羟喜树碱注射液在小鼠体内的药动学研究［J］.药学服务与研究，2007，7（3）：209－212.

［7］叶孟，潘宏铭，李楠，等.羟基喜树碱两种不同给药途径的药动学研究［J］.中国药科大学学报，2005，36（6）：531－534.

［8］胡婧，刘松青.羟基喜树碱缓释片在大鼠脑内的释放情况研究［J］.中国药房，2012，23（9）：797－799.

［责任编辑：陈曙娟］Development of a M ethod for HCPT Determ ination in Rat Plasma

LISi-yang
（Department of Medicine and Health Management，Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

This experimentaims at developing amethod for determining 10-OH camptothecin content in rat plasma.Detecting the content of HCPT and CPT by using high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence，this experiment establishes the linear regression equation and regression coefficientsabout the concentration of HCPT（X）and the peak area of HCPT ratio to the peak area of CPT（Y），and acquire regression coefficient in rat plasma.The result shows that HCPT and CPT in plasma can be better separated from other components，the concentration of plasma shows good linear relationship in the range of6.25～400 ng/mL and regression coefficient is 0.9988.Thismethod is easy to operate，has good reproducibility，and can be used to investigate the blood concentration.

HCPT；CPT；HPLC；plasma

TQ460

A

1006－8481（2014）03－0037－03

2013－11－09

李思阳（1987—），男，江苏食品药品职业技术学院医药与健康管理系讲师，硕士。