贝母素甲、贝母素乙对4T1乳腺癌细胞炎性微环境的干预调节作用❋

张玉人，林洪生，张 英

(1.中国中医科学院广安门医院,北京 100053；2.北京中医药大学,北京 100029)

乳腺癌系女性最常见的恶性肿瘤，在欧美国家乳腺癌约占女性新发恶性肿瘤的29%，而死亡率约占14%～15%[1]，其转移及复发是导致患者死亡的主要原因。而肿瘤的形成、侵袭性及复发转移行为，与癌细胞、炎性细胞因子、细胞外基质、成纤维细胞、免疫抑制细胞等构成的肿瘤微环境密切相关。研究结果显示，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)与炎症密切相关，是介导促炎细胞如Th17、Th9等分化的关键因子之一[2]；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)与炎症具有一定相辅相成关系[3]，二者在肿瘤微环境下相互调节；基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9, MMP-9)是重要的炎症介质，可促肿瘤细胞侵袭并与血管生成密切相关[4]；而单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)是β亚家族代表，可趋化单核细胞。

浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)为百合科贝母属植物干燥鳞茎，药性苦寒，具有清热化痰、解毒散结及抗炎功效。浙贝母碱(verticine)包括贝母素甲(Peimine)及贝母素乙(Peiminine)为其主要成分。由于4T1细胞为鼠源炎性乳腺癌细胞系，故以该细胞为实验对象拟研究贝母素甲及贝母素乙对乳腺癌细胞炎症相关肿瘤微环境的干预调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 小鼠4T1乳腺癌细胞株购自中科院上海细胞生物研究所。

1.1.2 主要试剂及药品 RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购于建成公司；含血清培养基(serum-supplemented medium, SSM)为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基； ELISA-TGFβ、VEGF、MMP-9、CBA-MCP-1试剂盒均购自R&D公司。Trizol、Reverse Transcribe High Capacity RNA-to-cDNA Kit、Gene Expression Master Mix、TGF-β1(Mm01178820_m1)、 VEGF(Mm01281449_m1)、MMP-9(Mm00442991_m1)、GAPDH (Mm99999915_g1)试剂盒及Taqman定制探针均购自life technologies公司。

贝母素甲、贝母素乙标准品(中国药品检验所)、顺铂注射液(云南个旧生物制药有限公司)。

1.1.3 主要仪器 实验所需主要仪器包括5% CO237℃恒温细胞培养箱(Sanyo公司)、Applied Biosystems Real-Time PCR 7500 System(ABI公司)、酶标仪(synergy HT, Biotek公司)、倒置显微镜(Nikon TE2000-U)。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 将20 mg贝母素甲、乙标准品溶于甲醇溶剂，总浓度5 mg/ml；顺铂200 mg溶于0.9%NaCl溶液，总浓度0.3 mg/ml。

1.2.2 乳腺癌4T1细胞株培养 复苏4T1细胞株，培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，置5% CO237℃恒温培养箱中培养，传代至对数生长期。

1.2.3 Cell Counting Kit-8 检测 取对数生长期细胞将浓度调整为2×104/ml接种于96孔板，每孔100 μl置于培养箱中培养， 24 h后弃去培养液，分别加入含贝母素甲、贝母素乙药品溶液及顺铂培养基200 μl/孔，贝母素甲、乙梯度浓度分别为5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L、100 μM/L；顺铂梯度浓度为0.1 μM/L、0.3 μM/L、1 μM/L、3 μM/L、10 μM/L、30 μM/L、100 μM/L；阴性对照组加入200 μl培养基，空白对照组不含细胞，各浓度均设6复孔。于加药后24 h、48 h、72 h分别加入CCK-8试剂，每孔10 μl，2 h后以酶标仪检测记录450 nm及630 nm吸光度值(A)，计算细胞不同时间、不同药物浓度的抑制率。抑制率(%)=[(阴性对照组A-空白对照组A)-(实验组A-空白对照组A)]/(阴性对照组A-空白对照组A)×100%。

1.2.4 炎性微环境相关因子水平检测 炎性微环境相关炎性因子及蛋白的含量主要通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)进行检测。具体指标为转化生长因子β(TGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属基质蛋白酶9(MMP-9)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)共4项指标。

将处于对数生长期4T1细胞接种于6孔板，设置贝母素甲、乙、顺铂及阴性对照组，以贝母素甲、乙及顺铂IC50(24 h)剂量干预4T1细胞24 h后提取上清，各组样本设置3复孔，使标准品及样本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤后每孔加入100 μl 酶标抗体，孵育2 h使固相免疫复合物上抗原与酶标抗体结合，避光加入100 μl酶催化底物，孵育30 min以100 μl 酸性酶反应终止液终止反应，根据颜色反应程度进行检测指标的定性及定量。酶标仪检测吸光度值A(检测波长为450 nm，矫正波长为570 nm)，将检测结果在EXCEL软件中转化为浓度进行统计分析。

1.2.5 实时荧光定量(RT-PCR)法检测 将细胞接种于6孔板1×105个/孔，根据两步法Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，以逆转录反应体系合成cDNA，将cDNA为模板使用荧光探针进行PCR扩增，包括TGF-β1 (Mm01178820_m1)、VEGF (Mm01281449_m1)及MMP-9(Mm00442991_m1)，GAPDH(Mm99999915_g1)为内参基因，依据RT-PCR反应曲线阈值循环数(ct)及RQ值相对定量，计算公式为：2-△△ct。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Cell Counting Kit-8检测结果

图1显示，5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L及100 μM/L贝母素甲、贝母素乙及顺铂干预4T1细胞24 h、48 h、72 h时抑制率，其中48 h贝母素甲、乙及顺铂IC50浓度分别为14.7 μM/L、 29 μM/L及 13 μM/L。

2.2 ELISA法各指标检测结果

表1显示，TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1检测结果如表1所示。无药物干预对照组4T1乳腺癌细胞对炎症相关因子TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1分泌量较高，贝母素甲组TGF-β、VEGF及MCP-1分泌量显著降低(P<0.05,P<0.01)；贝母素乙组TGF-β, MMP-9及MCP-1分泌量比较对照组显著降低(P<0.05,P<0.01)；顺铂组各指标均显著下降(P<0.01)。

2.3 RT-PCR检测结果

图1注：A. 各浓度贝母素甲24 h、48 h、72 h对4T1细胞抑制率；B. 各浓度贝母素乙24 h、48 h、72 h对4T1细胞抑制率；C. 各浓度顺铂24 h、48 h、72 h对4T1细胞抑制率

炎症相关因子对照组贝母素甲贝母素乙顺铂TGF-β0.621±0.0110.424±0.024**0.321±0.01**0.248±0.015**VEGF0.177±0.0030.158±0.008*0.202±0.010.015±0.003**MMP-97.108±0.4415.975±1.6015.615±0.067*5.048±0.013**MCP-10.326±0.0090.193±0.004**△△0.154±0.004**△△0.371±0.001**

注：与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01； 与顺铂组比较:△P<0.05,△△P<0.01

表2 各组细胞中TGF-β、VEGF、MMP-9的mRNA相对表达量

注：与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01； 与顺铂组比较:△P<0.05,△△P<0.01

3 讨论

恶性肿瘤的增殖、侵袭及转移与其炎性相关肿瘤微环境存在密切联系，近年来已成为研究热点。4T1细胞为高转移、三阴性乳腺癌细胞系，可分泌多种炎性相关因子，故本研究以4T1细胞为观察对象，探索中药单体贝母素甲和贝母素乙对4T1细胞及其相关炎性微环境的调控作用。

经研究显示，TGF-β是介导炎症强有力的趋化因子[5]，参与诱导Th17分化，促进炎症反应；而炎症与血管生成密切相关[6]，血管生成调节因子在各种炎症状态及促肿瘤生成和转移过程中均发挥着重要作用，其中VEGF不仅能够促血管内皮细胞生长、诱导异常血管生成[7]，且可抑制细胞凋亡，增加血管通透性，促肿瘤细胞转移；金属基质蛋白酶家族尤其是MMP-9作为炎症介质也参与了血管异常生成和细胞外基质降解，能够促进肿瘤细胞侵袭及迁移。这些炎症相关细胞因子对乳腺癌的浸润与转移发挥了至关重要的作用。

中药浙贝母具有清热解毒散结及抗炎功效，在乳腺癌的临床治疗中广泛应用，而贝母素甲、乙均为浙贝母碱主要成分之一。经本实验结果证明，贝母素甲及贝母素乙对4T1乳腺癌细胞具有显著抑制作用，并可有效降低炎性相关因子分泌及其 mRNA相对表达量，发挥抑炎功效。可以认为，中药单体贝母素甲、乙作为浙贝母有效成分，能够对乳腺癌细胞炎性微环境起到调控作用。此外，通过本次研究进一步挖掘了浙贝母的抗肿瘤功效，并对其药物有效成分的开发和利用提供了基础实验依据。

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