刮痧对局部组织中神经元型一氧化氮合酶和组胺的影响❋

徐东升，王莹莹，崔晶晶，杨金生△，白万柱

(1.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700; 2.陕西中医学院，西安 712046)

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级成年雄性Sprague Dawley大鼠5只，体质量(220±20)g，由中国医学科学院动物所提供(实验动物许可证号SCKX(军)2007-004)。实验过程参照并严格遵守美国国立卫生研究院的《实验动物照料和使用指南》。

1.2 试剂及仪器

试剂主要有兔抗nNOS抗体(rabbit anti nNOS, ab76067, Abcam, 香港)、兔抗HA抗体(rabbit anti HA, ab123982, Abcam, 香港)、Alexa 594荧光素化的山羊抗兔二次抗体(goat anti-rabbit Alexa 594 secondary antibody, Molecular Probes, 美国)。阳离子载玻片 (Thermo， Erie Scient if ic Company, 美国)。仪器主要有蠕动泵(BT300-2J, 保定兰格恒流泵有限公司)、恒冷箱切片机(FSE, Thermo, Microm International, 德国)和尼康光学图像分析仪(Nikon, Y-IDP, 日本)。

1.3 刮痧

在10% 乌拉坦(1 mL/100 g) 深度麻醉下，先剔除背毛暴露出脊柱两侧皮肤，经70%酒精擦洗后涂上刮痧油，然后用刮痧板沿脊柱一侧相当于人体膀胱经走行部位由上向下刮拭(从肺俞穴到胃俞穴)，至出现皮肤潮红，或红色粟粒状，或紫红色,或暗红色的血斑等变化，即“出痧”为止, 时间大约5 min。本研究用的5只大鼠，其中3只用于刮痧，另2只为正常对照。

1.4 灌流

出痧5 min后，对仍处于麻醉状态下的大鼠进行心脏灌流，同样正常对照大鼠也在深度麻醉下进行心脏灌流。 具体操作如下：迅速剪开胸腔, 经左心室将输液针管插入升主动脉, 剪开右心耳, 快速灌入生理盐水150 mL, 随后灌入300 mL 含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffered solution, PB, pH 7.4)的固定液, 约15 min 内灌流完毕。然后在灌流后大鼠的背部沿脊柱纵向切取皮肤组织, 将其放置于上述同样固定液中固定2～ 4 h, 再换到含25% 蔗糖的0.1 mol/ L PB (pH 7.4) 中，放置4℃冰箱里约2～3 d直至组织完全下沉。

1.5 组织切片制备

采用恒冷箱切片机进行组织切片。先用组织包埋剂将皮肤组织黏贴在支架上，待冻结后将组织制成20 mm厚的矢状切片，直接贴在阳离子载玻片上，并按顺序分为2组，然后放于室内阴干。

1.6 检测方法

对2组邻近切片分别进行圈染。先将内含3%山羊血清、0.5%Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH 7.4)的封闭液滴加到切片上孵育 1 h, 吸除封闭液后，分别加入含兔抗nNOS抗体(1∶1000)或兔抗HA抗体(1∶1000)的稀释液(1%山羊血清、0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB, pH 7.4)并置于摇床上过夜；次日经0.1 mol/L PB清洗3次后，将切片移入含Alexa 594荧光素化的山羊抗兔二次抗体(1∶500)的上述稀释液中，于室温放置 1 h后, 用 0.1 mol/L PB 清洗3次；待组织切片风干后，滴加50%甘油，加盖玻片完成标本制作。整个操作过程中注意避光。

1.7 图像处理

荧光免疫染色标记的标本采用尼康光学图像分析仪进行观察和拍照。文章中所使用的图片最后经Adobe Photoshop CS2(Adobe Systems, San Jose, CA, 美国)进行标注和编辑。

2 结果

图1显示，从外观上看，剃毛后的背部皮肤光洁润泽。经刮痧后的局部皮肤表面可以观察到轻度充血和肿胀的痧疹，与膀胱经伴行。图2、3显示，从痧疹出现部位的皮肤组织切片上看，nNOS和HA阳性标记物明显升高，显著高于它们在对照组织中的表达，并具有明显的形态学差异。

图1 刮痧前(左)后(右)皮肤的外观照片

图2 正常(A、A1)和刮痧后(B、B1)的皮肤组织显示nNOS阳性标记物比较。A1、B1分别为图A和B中箭头所指处的放大图片

图3 正常(A、A1)和刮痧后(B、B1)的皮肤组织显示HA阳性标记物的比较。A1、B1分别为图A和B中箭头所指处的放大图片

2.1 nNOS阳性表达

在正常的皮肤组织中有少量nNOS阳性标记物的存在，主要分布在表皮角质层、表皮细胞的间隙以及毛囊和血管周围(图2A, A1)。刮痧后的皮肤组织中，nNOS阳性标记物形成一条不连续的增强带，集中分布在表皮的细胞间隙(图2B, B1)。综合组内不同切片所见，nNOS阳性标记物增强主要出现在痧疹所在的部位。

（80）瓦氏皱指苔Telaranea wallichiana（Gottsche）R.M.Schust.

2.2 HA阳性表达

在正常的皮肤组织中有一定量HA阳性标记物的存在，主要分布在表皮角质层和表皮细胞的间隙(图3A, A1)。刮痧后的皮肤组织中，HA阳性标记物在表皮层与真皮层之间形成一条连续的增强带(图3B, B1)。综合组内不同切片所见，HA阳性标记物增强遍布痧疹所在部位的表皮层与真皮层之间。

需要说明的是，由于nNOS和HA在刮痧后局部皮肤组织中的阳性表达与二者在正常对照组织中的阳性表达存在明显的形态学差异，因此本研究仅对实验结果进行了形态学描述，而未对其进行定量分析。

3 讨论

本研究以大鼠为实验对象，用荧光免疫组织化学技术对刮痧引起的局部组织中nNOS和HA阳性标记的变化进行了观察。结果显示，刮痧能够促进局部组织中nNOS和HA阳性表达的上调，同时也表明荧光免疫组织化学技术可能成为在分子水平上揭示刮痧生物学效应的新手段。

刮痧刺激可引起局部皮肤组织中nNOS升高。NOS为多功能氧化-还原酶，是合成NO的关键因素。现已证明，NO是迄今为止在体内发现的第一个气体性细胞内及细胞间信息分子，广泛参与神经系统、免疫系统等众多生理病理过程，并在中枢与周围神经系统中发挥神经传导作用[8，9]。由于NO半衰期极短(5 s左右)且易扩散，难以直接测定，加之它在体内不能储存，所以本实验通过测定NOS活性的变化来间接反映NO的变化。需要说明的是，本研究采用nNOS抗体进行标记，nNOS和内皮型NOS均归属于结构型NOS，具有反应快、起效时间短的特点，更能迅速显示刮痧后局部组织中NOS的变化[8]。由于本研究采用的是nNOS抗体，我们推断刮痧引起局部皮肤组织中nNOS升高的原因可能源于刮痧对周围神经的刺激并使其向外周组织释放出nNOS。伴随着nNOS向外周组织的释放，刮痧是否可以引起中枢神经系统中nNOS表达的下调目前还不清楚。以往的针灸研究中显示，在慢性神经病理性模型动物上，针刺可能通过抑制中枢神经系统组织中nNOS的基因表达来改善症状[10～12]。如果同属于外部刺激疗法的刮痧能够像针刺一样发挥相似作用，那么刮痧的适用范围将会得到进一步扩展。

痧象的形成与HA有密切关系，HA是一种活性胺化合物。作为身体内的一种化学传导物质，HA参与中枢与周边的多重生理功能。在中枢系统，组胺可能参与睡眠、激素的分泌、体温调节、食欲与记忆形成等功能；在周边部分，HA可以影响许多细胞的反应，在过敏与发炎的调节上扮演很重要的角色[8]。在针灸研究中认为，针刺引起HA升高的可能与局部组织中肥大细胞脱颗粒有关，并由此产生一系列的级联效应[13,14]。刮痧使局部皮肤组织中的HA升高，可能与肥大细胞脱颗粒有关，尚需进一步探明，但HA的升高会直接导致血管扩张和毛细血管通透性增加[8]。因此刮痧在改善局部组织血液循环的同时，也可能引起少量的红细胞从毛细血管溢出，这可能是刮痧产生痧象的重要原因之一。

从上述分析可以看出，nNOS和HA都具有广谱的生物学效应。通过本研究证实，刮痧能够促进局部组织nNOS和HA表达的上调，这可能与刮痧的作用机制密切相关。虽然本研究还不能明确刮痧是否可以通过对nNOS和HA的调节激发更多的生物学效应，但刮痧引起局部组织中nNOS和HA表达的上调是肯定的。二者在合理范围内的上调可能发挥积极的治疗作用，而过度的上调又可能会产生细胞毒性作用对机体构成伤害[8]，过度的或者强刺激同样也会导致皮肤组织的形态学发生改变[15]。因此，选择适当的刺激量将成为刮痧标准制定和临床实际操作中必须面对的研究课题。

总之，在正常状态下皮肤是一种稳态结构，刮痧主要通过刺激局部皮肤的浅层发挥作用。刮痧可能使局部皮肤组织的稳态被打破由静止状态而转为激活状态，其中nNOS和HA成分的增加可能是刮痧激发生物学效应的始动环节之一。通过本研究的尝试，为我们今后进一步在动物病理模型上研究刮痧

后不同时程局部组织中以及中枢神经系统中nNOS和HA表达的动态变化提供有效的技术手段，可以期待荧光免疫组织化学技术将为揭示刮痧的生物学效应提供更多的实验依据。

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