不同产地的贝母中主要生物碱的含量比较及其毒性评价

李小平， 陈渝珂， 朱 明

（1.苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215008；2.上海中医药大学，上海 201210）

贝母药材来源于百合科贝母属数种植物的干燥鳞茎，始载于《神农本草经》，列为中品，自唐代以后，以贝母属植物作为中药贝母正品一直沿用至今。川贝母和浙贝母为大宗药材，野生川贝母逐年减少，造成其市场价格昂贵，混伪品繁多。2020年版中国药典收载有川贝母、伊贝母、浙贝母、湖北贝母和平贝母5大类贝母药材（国家药典委员会编，2020），各地还有几十种贝母属植物的鳞茎习惯性作为贝母入药。贝母素甲、贝母素乙是浙贝母饮片中常用的质控指标 （国家药典委员会编，2020；赵耀东等，2013；曾荣香等，2009；程显隆等，2008；薛燕和顾好粮，2005）；贝母素乙是湖北贝母质控指标，也是川贝母鉴别的对照品（国家药典委员会编，2020）。近来研究发现，贝母辛具有很好的平喘作用（赵益等，2009），并在瓦布贝母（刘晶等，2010）、太白贝母（王怀玉等，2011；刘晶等，2010）、彭泽贝母（刘红宁等，2010）、伊贝母（段宝忠等，2010）、川贝母（黄林芳等，2009）、炉贝母（蒋玉虎等，2014）、新疆贝母（刘玉明等，2014；邹和平等，2014）、康定贝母（邹和平等，2014）等不同种类贝母的研究中作为质控指标进行检测。为了保证用药安全有效，扩大用药资源，本文采用HPLCELSD法对9个不同产地贝母中3种生物碱贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量进行测定，比较不同产地贝母药材中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量差异，并对贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的细胞毒性进行研究，旨在为开发利用贝母资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器、供试材料及试验动物

1.1.1 供试材料 本试验共收集到9个不同产地的5大类贝母药材，经鉴定，涵盖了2020年版《中华人民共和国药典》（一部）收载的浙贝母、伊贝母、平贝母、川贝母和湖北贝母所有种类的贝母药材。S1、S2、S3、S4、S5号生药样品由四川大学鉴定，S6、S7、S8、S9号生药样品由上海中医药大学鉴定，具体样品来源见表1。

表1 样品来源

1.1.2 试剂 对照品贝母辛（110892-201911）、贝母 素 甲 （110750-201908）、 贝 母 素 乙 （110751-201909）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%；乙睛为色谱纯（美国Fisher公司），四甲基偶氮噻唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，牛胎血清（FBS）购自美国Gibco-BRL公司，其他试剂为分析纯。

1.1.3 仪器Waters e2695高效液相色谱仪；Waters 2420 ELSD检 测 器 ；Empower2色 谱 工 作站；Newllassic MF电子天平（瑞士Mettler公司）；酸度计（瑞士Mettler公司）；RV 10D S25旋转蒸发仪（德国IKA公司）；Milli-Q超纯水仪 （Millipore公司）；InfiniteF50酶标仪（TECAN有限公司）。

1.1.4 试验动物 清洁级BALB/c小鼠，雄性，8～10周龄，重18～20 g，购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品储备液的制备 精密称取贝母辛、贝母素甲和贝母素乙对照品适量，分别加甲醇制成含贝母辛1.8 mg/mL，含贝母素甲0.4 mg/mL，含贝母素乙1.2 mg/mL的混合对照品储备液；于4℃冷藏保存，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 取样品粉末 （过四号筛）约2.0 g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4 mL浸润1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4:1）40 mL，称量，混匀，置80℃水浴中加热回流2 h，放冷，再称量，加三氯甲烷-甲醇（4:1）补足减失的量，滤过。精密量取滤液10 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，然后过0.45 μm微孔滤膜，即得。每个样品平行制备3份供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液；梯度洗脱（0～10 min，25%A，10～20 min，25%A→40%A，20～25 min，40%A→95%A，25～50 min，95%A）； 柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；漂移管温度：40℃；载气流速：2.0 L/min。

1.2.4 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下迅速分离小鼠脾脏，置于冷的PBS下冲洗，剥去结缔组织并以200目不锈钢筛网轻轻研磨过滤。收集细胞，用PBS洗涤2次（4℃，250 g，5 min）之后，再用RPMI-1640培养基（25 mmol/L的谷氨酰胺、100 IU/mL的青霉素、80 IU/mL的链霉素、体积分数为0.1%的β-二巯基乙醇和10%的胎牛血清）重悬细胞，配制成密度为2×106个/mL的细胞悬液。每孔200 μL细胞悬液接种于96孔板，最后置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2.5 MTT比色法检测贝母素甲、贝母素乙和贝母辛对小鼠脾淋巴细胞的药物毒性 按“1.2.4”项下方法在96孔板中接种200 μL细胞密度为2×106个/mL的细胞悬液，细胞悬液中加入不同浓度的贝母辛、贝母素甲和贝母素乙 （终浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），每个剂量设3个复孔。在37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μL（质量浓度为5 mg/L）的MTT，置于培养箱继续避光孵育4 h后，离心（300 g，5 min）弃上清，每孔加入100 μL的DMSO，振荡10 min，在酶标仪上570 nm波长检测各孔吸光度（A），计算细胞的相对存活率。并利用Reed-Muench法，计算出贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的CC50即对50%的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度。

1.3 方法学考察

1.3.1 线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量，以甲醇稀释，得到6个浓度梯度的混合对照品溶液。精密吸取6个浓度的混合对照品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，考察贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的线性关系。

1.3.2 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次；记录贝母辛、贝母素甲和贝母素乙峰面积，分别计算贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的RSD。

1.3.3 重复性实验 精密称取同一批次浙贝母药材粉末6份，按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液6份，按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次；记录贝母辛、贝母素甲和贝母素乙峰面积，分别计算贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”项下色谱条件进行测定；记录贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的峰面积，分别计算贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.5 加样回收率实验 精密称取已知含量的浙贝母样品1.0 g，共6份，置圆底烧瓶中，分别精密加入对照品贝母辛0.8 mg、贝母素甲0.1 mg、贝母素乙1.0 mg，按“1.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率及RSD。

1.3.6 贝母样品中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量测定 精密称取9个不同产地的贝母样品，分别按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，计算结果。

2 结果与分析

2.1 样品及对照品色谱图 在本实验色谱条件下，可见供试品溶液及对照品溶液基线平稳，各色谱峰分离度好，其他成分无干扰（图1）。

图1 对照品（A）及样品（B）的HPLC-ELSD色谱图

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系 测定贝母辛、贝母素甲和贝母素乙峰面积，以峰面积积分值（Y）对溶液质量浓度（X）进行线性回归，得到贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的回归方程分别为：贝母辛，Y1=1.7953X1+13.221，r1=0.9992； 贝 母 素 甲 ，Y2=1.8021X2+12.863，r2=0.9991； 贝 母 素 乙 ，Y3=1.8127X3+12.478，r3=0.9997;表明贝母辛、贝母素甲、贝母乙素在质量浓度3.6～288、0.8～64、2.4～192 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2.2 精密度实验 贝母辛、贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为2.13%、1.97%和1.78%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性实验 贝母辛、贝母素甲和贝母素乙含量的平均值分别为267.4、94.5、304.7 μg/g，RSD分别为1.95%、2.27%和2.03%，表明该方法重现性良好。

2.2.4 稳定性实验 贝母辛、贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为1.87%、2.05%、1.96%；表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 加样回收率实验 贝母辛、贝母素甲和贝母素乙平均回收率分别为101.13%、99.26%、101.29%，RSD分别为2.03%、1.95%和2.56%，表明该方法准确可靠。

2.3 样品中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙含量的测定结果 由表2可知，9个不同产地的5大类贝母中，在达到定量限的供试品中，贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量分别在19.7～937.6、6.2～221.2、31.2～599.2 μg/g。 其中，贝母辛在川贝母中含量最高，贝母素甲在梭砂贝母含量最高，贝母素乙在湖北贝母中含量最高。

表2 不同产地贝母中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙含量 μg/g

2.4 贝母辛、贝母素甲和贝母素乙细胞毒性的评价 分别用0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的贝母辛、贝母素甲、贝母素乙处理小鼠脾淋巴细胞后，细胞相对存活率及CC50如表3所示。

表3 贝母辛、贝母素甲、贝母素乙对小鼠脾脏淋巴细胞的毒性

由上述结果可知，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的半数致死量 （CC50）分别为65.38、146.8、91.44 μg/mL，其中，贝母辛对细胞毒性最大（CC50＝65.38 μg/mL）。 依据William S.Stokes（程显隆等，2008）建立的体外实验对于急性毒性实验起始剂量的公式：log（LD50）＝0.435×log（IC50）+0.625，IC50＝CC50＝65.38 μg/mL，计算出小鼠的LD50为0.796 g/kg。默认每日服药量为ED50，治疗指数TI＝LD50/ED50，依据经验值，人的剂量为LD50＝0.796/9×70＝6.191 g。贝母辛在川贝母中的含量最高，为937.6 μg/g，《中国药典》2020版（一部）记载川贝母的用药量为3～10 g（程显隆等，2008），得出川贝母的治疗指数（TI）为661～2203。 当治疗指数TI＞10时，说明用药安全，故在不考虑贝母辛对胚胎细胞潜在致畸毒性的前提下，可认为不同产地贝母的临床用药安全。

3 结论与讨论

贝母中的主要活性物质生物碱的化学结构中没有共轭双键和发光团，不能直接用紫外检测器进行分析和检测。HPLC-ELSD适合于没有紫外吸收、不易挥发的化学成分的含量测定。本文采用HPLC-ELSD方法对9个产地的贝母中贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的含量进行测定和比较分析，该方法灵敏度高，干扰少，重现性好，是检测贝母中甾体和异甾体生物碱有效、简便的分析方法。

不同产地贝母药材中，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙含量测定的结果显示，浙贝母和湖北贝母中3种生物碱含量都较高。平贝母中3种生物碱含量都很低，均只达到检测线，但未达到定量限，这与周剑侠等（2006）的研究结论相符，即平贝母中单一生物碱成分含量过低，不宜作为平贝母药材的质量控制指标；以平贝母中总生物碱含量作为质量控制指标，能更客观地反映平贝母活性成分情况。在伊犁贝母中，贝母素甲和贝母素乙含量都较低，贝母辛含量相对较高，与文献报道相符。瓦布贝母和浓密贝母是川贝母的新培育品种，瓦布贝母中贝母辛和贝母素乙含量都较高；贝母辛、贝母素甲和贝母素乙三个单体成分，在暗紫贝母、川贝母、梭砂贝母等组成的川贝母复合群中，整体含量偏低。贝母素甲在瓦布贝母中达到检测限，但未达到定量限（朱明，2011）。

周剑侠等（2006）研究表明，当异甾体生物碱结构中同时存在醚氧结构和呋喃环时可能会对妊娠期的动物和人的胚胎产生致畸作用。本文所测贝母的3种生物碱中川贝母中贝母辛的含量最高，川贝具有悠久的应用历史，一直是贝母药材重要品种之一，故贝母辛的遗传毒性仍需引起关注。